流式实验避坑指南（五）：为什么固定后，流式抗体的检测信号会发生变化？

在流式细胞术实验中，固定（Fixation）是许多实验流程中的关键步骤。无论是为了保存细胞状态、延长样本处理时间，还是进行胞内蛋白、转录因子以及细胞因子检测，固定处理都被广泛应用。然而，在实际实验过程中，研究人员经常会遇到这样的问题：同一个Marker，在未固定细胞中染色效果良好，但经过固定处理后，荧光信号明显降低；或者同一个Marker，使用不同抗体Clone检测时，固定后的表现存在明显差异。这种现象容易被简单归因于“抗体性能不好”或者“实验操作问题”，但实际上，固定步骤本身可能同时影响多个环节，包括：

• •    抗原表位的结构变化；
• •    抗体与抗原的结合效率；
• •    荧光标记物的稳定性。

因此，固定后的检测信号变化，并不一定代表目标蛋白表达发生改变，而可能是固定条件、抗体特性以及荧光染料共同作用的结果。

图1. 固定后抗体染色效果发生变化

一、固定为什么会影响流式抗体检测？

流式细胞术检测的基础，是荧光标记抗体与目标抗原之间的特异性结合。需要注意的是，抗体检测到的并不是细胞中目标蛋白的“总量”，而是抗体能够识别的特定抗原表位（Epitope）。对于同一个蛋白而言，真正决定抗体是否能够结合的，并不是蛋白是否存在，而是抗体所识别的区域是否保持了合适的空间结构。固定过程可能改变这一过程。目前流式实验中常见的固定方式主要包括醛类固定和有机溶剂固定两大类。其中，多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）和甲醛（Formaldehyde）属于典型的醛类固定剂，主要通过形成蛋白交联来稳定细胞结构。这种固定方式能够较好地保存细胞形态以及蛋白空间分布，因此被广泛应用于表面Marker固定、胞内细胞因子检测以及转录因子分析。

蛋白交联也可能导致抗原结构发生变化。当蛋白之间形成交联后，部分抗原表位可能发生空间重排，或者原本暴露在蛋白表面的区域被遮挡，使抗体结合效率下降。即使细胞内目标蛋白表达水平没有变化，抗体也可能因为无法有效识别固定后的抗原表位，而表现为荧光信号降低。

除了醛类固定剂外，甲醇（Methanol）、乙醇（Ethanol）等有机溶剂也被应用于部分流式实验，例如磷酸化蛋白检测。与醛类固定不同，有机溶剂主要通过蛋白沉淀和脱水作用改变细胞状态，因此对抗原结构的影响方式也不同。一些在PFA固定条件下能够保持稳定的抗原，在甲醇固定后可能出现表位破坏；而部分适合有机溶剂固定的目标蛋白，在醛类固定体系下反而可能表现不佳。

因此，固定并不是一个简单的“保存细胞”的过程，而是会直接影响抗原结构和抗体识别的关键实验因素。换句话说：固定影响的不一定是Marker表达水平，而可能是抗体是否还能有效识别该Marker。这也是为什么在部分实验中，固定前后的流式染色结果可能存在明显差异。

表1. 流式常用固定剂特性对比

二、为什么不同抗体Clone对固定的耐受程度不同？

在实际实验中，经常会观察到这样的情况：针对同一个Marker，不同抗体Clone在固定后的检测效果并不完全一致。这并不是偶然现象，而与抗体识别的抗原表位密切相关。同一个蛋白分子通常包含多个不同区域，不同抗体Clone识别的是其中不同的表位。当固定导致蛋白结构发生变化时，不同表位受到影响的程度可能存在明显差异。

例如，FoxP3检测就是一个经典案例。FoxP3是一种位于细胞核内的转录因子，由于目标蛋白位于细胞内部，检测时通常需要经过固定和通透处理，使抗体能够进入细胞核完成染色。然而，不同FoxP3抗体Clone对于固定/通透体系的兼容性并不完全一致。

图2. 不同克隆号Foxp3固定后的不同表现（DOI: 10.1002/cyto.a.20815）

类似情况也存在于一些常见表面Marker中。例如CD3、CD4、CD8等分子，虽然都是流式实验中常用的检测指标，但不同Clone识别的Epitope位置不同，固定后可能表现出不同程度的信号变化。

图3. 不同克隆号CD56固定后的不同表现

因此：Marker名称相同，并不意味着所有抗体Clone都具有相同的固定兼容性。在涉及固定或通透的实验中，抗体Clone信息以及应用验证条件，与Marker本身同样重要。

表2. 不同克隆号抗体固定/渗透后性能变化

三、固定影响的不只是抗原，也可能影响荧光信号

流式检测最终获得的是荧光信号，而这一信号来自两个连续过程：抗体是否能够有效结合目标抗原，以及荧光标记是否能够产生稳定信号。因此，即使抗体仍然能够识别目标蛋白，如果荧光染料本身受到固定或通透条件影响，也可能导致最终检测结果发生变化。

不同荧光染料具有不同的化学结构，因此对于固定条件的耐受能力也存在差异。在实际流式实验中，最需要关注固定影响的往往是串联染料（Tandem dyes）。这类荧光素通过多个荧光基团之间的能量转移产生最终信号，例如PE-Cy7、APC-Cy7、PE-Cy5.5等。由于串联染料的荧光产生依赖多个荧光基团之间的协同作用，因此相比FITC、PE、APC等单体荧光素，其化学稳定性更容易受到实验环境影响。在固定、长期保存或者部分通透条件下，串联染料可能出现能量转移效率下降，从而导致荧光强度降低，甚至出现光谱特征变化。尤其是在需要经过固定和通透的胞内染色实验中，PE-Cy7、APC-Cy7等染料通常需要更加谨慎地评估其兼容性。

图4. 固定导致串联染料信号强度下降（DOI: 10.1002/cyto.a.24904）

除了串联染料外，PE和APC等常用高亮度荧光素也并非完全不受固定影响。虽然这些荧光素通常具有较好的稳定性，但在某些固定体系、较长固定时间或者后续通透条件下，也可能出现信号变化。相比之下，FITC等传统荧光素通常具有较好的固定耐受性，但这并不意味着所有情况下都不会受到影响。固定剂类型、固定强度、处理时间以及样本类型都会影响最终检测表现。

因此，在涉及固定的实验中，不能简单认为某一种荧光素一定适合或一定不适合固定实验。更准确的理解是：荧光兼容性并不是由荧光素单独决定，而是由荧光标记、抗体Clone以及固定/通透体系共同决定。实际实验中，固定后信号下降往往不是单一因素造成的：既可能是抗原表位被固定破坏导致抗体结合效率下降，也可能是抗体克隆本身与固定体系不匹配，还可能是抗体结合正常但荧光染料发生了降解。三者共同决定了最终的染色表现，这也是固定相关实验需要系统性评估，而不能只单一优化某一个环节的原因。

四、哪些流式实验尤其需要关注固定兼容性？

1. 胞内细胞因子检测

胞内细胞因子染色（Intracellular Cytokine Staining，ICS）通常需要经过：刺激→蛋白运输阻断→固定→通透→胞内染色。在这一过程中，固定不仅需要保持细胞结构，还需要尽可能保存目标蛋白状态。如果固定条件不合适，可能导致：细胞因子表位改变；抗体进入能力下降；不同样本之间信号差异扩大。因此，ICS实验中通常需要选择经过对应Fix/Perm体系验证的抗体Clone，而不是简单根据Marker名称选择抗体。

2. 转录因子检测

FoxP3、T-bet、GATA3、RORγt等转录因子检测，同样高度依赖固定和通透条件。由于这些蛋白位于细胞核内部，抗体必须穿过细胞膜和核膜才能完成染色。不同Fix/Perm体系对于核蛋白结构的影响不同，因此同一个Clone在不同体系下可能产生完全不同的检测结果。如图2所示，不同克隆号的FoxP3抗体与固定/通透体系之间存在明显的匹配关系。因此，在转录因子检测中，“选择抗体Clone”和“选择Fix/Perm体系”实际上是一个整体，而不是两个独立步骤。

3. 磷酸化蛋白检测

磷酸化流式（Phospho-flow）是另一类高度依赖固定条件的实验。pSTAT、pERK、pAKT等信号分子的磷酸化状态通常变化非常迅速，如果样本处理过程中不能及时固定，可能导致信号快速丢失。因此，Phospho-flow通常强调快速固定，以锁定细胞刺激后的瞬时状态。但与此同时，不同固定方式也会影响抗体识别。例如，甲醇固定能够有效保存部分磷酸化表位，因此被广泛应用于Phospho-flow；但对于许多表面Marker而言，甲醇可能导致明显信号损失。

五、如何减少固定导致的检测偏差？

固定导致的信号变化并不是完全无法避免，但可以通过合理的实验设计降低影响。首先，需要在实验设计阶段考虑固定需求。很多实验失败的原因，并不是抗体本身性能不足，而是在实验开始时没有考虑抗体Clone、荧光标记和Fix/Perm体系之间的匹配关系。例如，如果实验需要检测FoxP3、T-bet等核内蛋白，那么选择抗体时不能只关注Marker名称，而需要确认该Clone是否经过相应Fix/Perm体系验证。

同样，对于需要固定的多色Panel，也需要提前考虑荧光标记的稳定性。例如，在包含固定步骤的Panel中，如果关键Marker使用PE-Cy7或APC-Cy7等串联染料，应充分评估固定后信号变化风险。如果实验条件允许，可以通过预实验比较固定前后的信号变化。这里需要关注的并不仅仅是“是否还能看到阳性群体”。很多情况下，一个抗体固定后仍然能够显示阳性，但阳性群体分离度已经明显下降。因此，更有意义的评价指标包括：阳性群体与阴性群体之间的分离程度；平均荧光强度（MFI）的变化；不同处理条件下结果的一致性。例如，一个Marker固定前MFI较高，但固定后下降50%，并且阳性与阴性群体重叠增加，那么即使仍然存在阳性信号，也说明该检测体系并不理想。

此外，固定条件本身也需要进行优化。固定时间过短，可能无法充分保存细胞结构；固定时间过长，则可能导致过度交联，使部分抗原表位被遮挡。对于常规PFA固定，实验中常见的是短时间固定条件，而长时间固定或长期保存样本通常需要重新验证抗体兼容性。同时，不同商业Fix/Perm体系之间也不能简单替换。例如，用于FoxP3检测的专用Fix/Perm体系通常经过特定Clone验证，而将同一个Clone直接转移到另一套固定/通透体系中，可能得到不同结果。因此，固定体系、抗体Clone和实验目标应该作为一个整体进行考虑。

六、固定相关实验中的常见误区

误区一：固定后信号降低，说明蛋白表达下降

这是最常见的错误判断。流式抗体检测的是抗体可识别的表位，而不是蛋白绝对含量。如果固定导致表位结构变化，即使蛋白数量没有改变，也可能出现信号降低。因此，固定前后的MFI变化不能直接等同于蛋白表达变化。

误区二：同一个Marker，任何Clone都可以用于固定实验

Marker名称相同，并不代表不同Clone具有相同性能。FoxP3检测已经证明，不同Clone对于Fix/Perm体系存在明显差异。类似情况也存在于CD4、CD8、CD62L、CCR7等多个常见Marker中。因此，在固定相关实验中，Clone信息与Marker名称同样重要。

误区三：高亮度荧光一定适合固定实验

在多色Panel设计中，研究人员通常倾向于将高表达Marker搭配较弱荧光，将低表达Marker搭配高亮度荧光。这种原则本身没有问题。但对于固定实验而言，还需要额外考虑荧光稳定性。例如PE-Cy7、APC-Cy7虽然亮度较高，但由于串联染料结构特点，在固定和长期保存条件下可能存在信号变化风险。因此，“最亮”并不一定代表“最合适”。

结语

固定是流式实验中常用的重要步骤，但它并不是一个完全不会影响检测结果的处理过程。固定可能改变抗原结构，使部分抗原表位发生变化；同时，不同荧光标记也可能对固定和通透条件表现出不同程度的敏感性。

因此，固定后的流式检测结果，需要综合考虑：抗体Clone特性；抗原表位结构；荧光标记稳定性；固定/通透实验条件。理解抗体与固定之间的兼容关系，有助于避免因固定条件不匹配导致的信号下降或结果偏差，从而获得更加稳定、可靠的流式检测数据。

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参考文献

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