流式结果到底看阳性率还是MFI？从群体比例到荧光强度，理解不同Marker的判读逻辑

流式细胞术结果的分析不仅涉及细胞群体的识别，还涉及对荧光信号分布的定量描述。对于同一个Marker，采用阳性率还是荧光强度进行统计，并不存在适用于所有实验的统一标准，其选择取决于实验所关注的生物学变化以及目标群体的分布特征。

例如，在处理前后比较某个激活Marker时，阳性细胞比例可能变化有限，但阳性群体的荧光分布却整体向高荧光方向移动。此时，仅比较阳性率可能无法充分反映信号水平的变化，而荧光强度统计则能够进一步描述目标群体内部的荧光信号差异。

图1. 流式实验结果的不同展示方式

一、流式结果中阳性率与荧光强度的差异

流式细胞术同时具有“分群”和“定量”两种属性，不同实验问题对应的统计重点并不相同。

当某个Marker被用来区分不同细胞群体时，核心问题通常是目标群体所占的比例。例如，在PBMC中分析CD4、CD8、B细胞或NK细胞时，关注的通常是某一细胞群体在其父群体中的比例。此时，阳性率反映的是群体组成特征。

图2. 不同处理导致细胞阳性率发生变化（DOI: 10.3389/fimmu.2023.1096096）

以CD4和CD8为例，经过合理的门控后，CD4+细胞从30%增加到50%，最直接的解释是目标群体所占比例发生了变化。对于这一类问题，并不需要首先比较每个CD4+细胞的荧光信号强度。

另一类实验所关注的则是同一细胞群体内部的Marker信号变化，例如，当实验目的在于判断处理后某个激活Marker的表达信号是否增强时，仅统计阳性细胞比例可能不足以完整描述结果，此时需要进一步观察整个荧光分布，并选择适当的荧光强度统计量。

阳性率和荧光强度反映的是两个不同层面的信息：阳性率描述的是在特定判定边界下，有多少事件被归入目标群体；荧光强度则描述目标群体内部信号的分布特征。因此，在同一组流式数据中，阳性率和荧光强度可能得出不同但并不矛盾的结论。

二、从阳性率判断细胞群体比例

阳性率的获得依赖于预先确定的判定边界，即根据阴性与阳性群体的分布特征，将事件划分为阳性或阴性，并计算目标群体在父群体中的比例。对于CD4、CD8、CD19、CD56等主要用于定义细胞群体的指标，如果实验目的本身就是比较不同细胞亚群的组成，阳性率通常是最直接的统计指标。

同一个Marker在不同实验中也可能对应不同的统计问题。例如，当实验关注的是“处理后CD4+ T细胞在T细胞中的比例是否发生变化”时，阳性率是核心结果；而当实验关注的是“CD4+ T细胞表面的CD4信号水平是否发生变化”时，分析重点已经从细胞群体组成转向荧光信号水平。

因此，某个Marker并不存在天然固定的统计指标。只有当Marker承担细胞群体定义功能，并且实验关注的是群体组成变化时，阳性率才具有更直接的生物学意义。

同时需要注意，阳性率并不是一个脱离判定标准而独立存在的数值。其结果取决于阳性群体的定义、阴性对照以及具体门控策略。因此，在报告阳性率时，还应明确其对应的父群体。例如，“占总细胞比例”和“占CD3+细胞比例”反映的是不同的群体关系，不能直接视为同一统计结果。

三、从荧光强度判断群体内信号变化

当Marker已经在相当比例的细胞中表达时，仅依靠阳性率可能无法充分反映处理前后的变化。例如，假设处理前80%的细胞已经被判定为Marker阳性，处理后阳性率仍为82%。从比例变化来看，仅增加了2个百分点。然而，如果处理后原有阳性群体的荧光信号整体向高荧光方向移动，则两个样本之间仍可能存在明显的信号水平差异。这是因为阳性率只记录事件是否超过阳性判定边界，而不会进一步区分超过这一边界后信号水平的具体变化。

例如，PMA-ION刺激T细胞后，对CD69进行动态分析，可以看到部分时间点的CD69+细胞比例已经维持在较高水平，而不同处理条件下的几何平均荧光强度存在差异。这样的结果说明，当阳性群体已经存在时，Marker发生的变化可能主要体现为信号水平变化，而不一定表现为更多细胞跨过阳性判定阈值。

图3. PMA-ION刺激后CD69+细胞比例及平均荧光强度变化（DOI: 10.1128/cdli.9.2.243-250.2001）

因此，面对一个“阳性率基本不变”的结果，不能直接得出“Marker没有变化”的结论。更合理的判读方式是进一步观察Histogram或者对应群体的荧光分布：阳性群体有没有整体右移？分布宽度有没有变化？有没有出现新的高表达亚群？只有结合实际分布特征，才能判断是否需要进一步采用荧光强度进行定量比较。

四、阳性率与荧光强度同时变化时如何分析

部分实验中：处理后阳性细胞比例增加，同时阳性群体的荧光强度也升高。此时，两个指标分别反映不同层面的生物学变化。

例如，一个活化Marker处理前有30%的细胞为阳性，处理后增加到60%；与此同时，阳性群体的荧光中位数也明显升高。此时，如果只报告60%的阳性率，会遗漏“阳性细胞自身的信号还发生了增强”这一层信息；而如果只报告荧光强度，又无法说明阳性细胞的覆盖范围扩大了多少。类似的情况可见于对T细胞进行不同强度的TCR刺激后，CD69和CD25的分析可以同时观察到阳性细胞比例以及阳性细胞几何平均荧光强度的变化。前者反映有多少细胞产生了相应的响应，后者则反映响应细胞内部信号水平的差异。

图4. 不同强度的TCR刺激后，CD69和CD25的阳性细胞比例及几何平均荧光强度（DOI: 10.7554/eLife.10134）

因此，当两个指标同时变化时，不需要在两者之间进行简单取舍，而应根据实验问题判断是否有必要联合报告。阳性率告诉你变化涉及多少细胞，荧光强度告诉你这些细胞的信号水平发生了怎样的变化。

五、MFI的统计含义与荧光强度的计算方式

确定需要进一步比较荧光强度后，还需要明确具体采用哪一种统计量。实际流式数据中常见的荧光强度统计量包括Median、Arithmetic Mean、Geometric Mean以及Mode，但不同软件和不同研究中对“MFI”的使用并不完全一致。

图5. 常见荧光强度统计量

因此，“MFI”在不同文献中的实际含义并不完全统一。当一篇论文写“the MFI increased”时，仅凭“MFI”这一表述无法判断作者具体采用的是Median、Arithmetic Mean还是Geometric Mean。较为可靠的信息通常来自论文的方法部分、图注以及具体软件输出的统计定义。

从规范报告的角度来看，“MFI increased”并不是一个完整的统计描述。更明确的方式是直接说明所采用的统计量，例如Median Fluorescence Intensity或Geometric Mean Fluorescence Intensity。

此外，流式中的荧光强度是检测体系产生的信号，并不等同于抗原分子的绝对表达量。抗体克隆、荧光素、抗体浓度、染色条件、仪器设置以及数据处理方式都会影响最终的荧光信号。因此，荧光强度更适合在相对一致的实验体系内进行条件间比较，而不应脱离实验体系直接比较不同实验或不同仪器获得的绝对数值。如果需要进一步估算抗原分子数量，则需要经过校准的定量方法，而不能仅凭普通流式中的MFI直接推算。

六、基于实验目的与数据分布的Marker统计指标选择

回到“不同Marker应该看什么”这一问题，更合理的做法并不是按照Marker名称建立固定的统计指标对应关系，而是结合实验目的和实际数据进行判断。

因此，CD4、CD8、CD69、CD25或PD-1等Marker并不存在固定的“阳性率指标”或“MFI指标”。同一个Marker在不同实验目的下，也可能需要采用不同的统计方式。最终统计指标的选择取决于Marker在当前实验中的分析功能、目标群体的分布特征，以及实验需要回答的生物学问题。

结语

流式细胞术中的统计结果，本质上是对细胞群体和信号分布进行概括。阳性率、Median、Geometric Mean或Arithmetic Mean都只是对数据某一层面的描述，并不能脱离流式图和实验目的独立解释。

一个合理的流式判读过程应该建立在数据本身之上：先识别目标群体及其分布特征，再判断观察到的变化究竟属于群体比例变化、信号水平变化还是群体结构变化，最后使用能够与这种变化相对应的统计指标进行描述。只有当统计结果与实际数据分布和实验问题相互对应时，阳性率或荧光强度才真正具有明确的生物学解释。

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