流式细胞术染色方案：表面染色、胞内细胞因子及磷酸化蛋白检测

发布日期: 2026-10-08 访问次数: 120

流式细胞术依赖荧光素偶联抗体与细胞表面或胞内抗原的特异性结合。染色质量直接决定信噪比和数据可靠性。本方案提供表面染色、胞内染色和多色方案设计的分步操作指南，并附有常见问题的故障排除方案。

开始之前：所有抗体在正式实验前都应针对具体的细胞类型和仪器进行滴定。以下浓度仅为推荐起始值——最佳用量因靶点表达水平、荧光素亮度和流式仪灵敏度而异。

1. 试剂和材料

试剂	配制方法 / 注意事项
FACS 缓冲液（染色缓冲液）	PBS + 1–2% FBS（或 0.5% BSA）+ 0.1% 叠氮钠（NaN₃）。过滤除菌，4 °C 保存。
Fc 封闭剂	Anti-CD16/CD32（小鼠）或 Human TruStain FcX（人）。封闭 Fcγ 受体，减少非特异性结合。
固定液	2–4% 多聚甲醛（PFA）/ PBS。现配现用或使用一次性安瓿。勿使用陈旧 PFA——降解释放的甲醇会损坏 PE/APC 串联染料。
通透液	0.1% 皂苷（saponin）/ FACS 缓冲液（用于细胞因子）或 90% 冰冷甲醇（用于磷酸化蛋白）。选择取决于靶点——详见第 4 部分。
活性染料	可固定活性染料（如 Zombie Aqua、LIVE/DEAD Fixable）或非固定型染料（PI、7-AAD）。可固定型染料在表面染色之前加入；PI/7-AAD 在上机前 5 分钟加入。
红细胞裂解液	1× 氯化铵基裂解液。全血或未分离的脾细胞实验时必需。
蛋白转运抑制剂	布雷菲德菌素 A（BFA，1×）或莫能菌素（Monensin，1×）。胞内细胞因子染色时必需——在刺激过程中加入以将细胞因子截留在高尔基体/内质网中。

设备：配有相应激光的流式细胞仪、离心机（300–500 × g）、FACS 管（5 mL 圆底聚苯乙烯管）或 96 孔 U/V 底板、冰盒、计时器。

2. 样品制备

培养细胞（贴壁或悬浮）

收获细胞。贴壁细胞使用无酶解离液或短时胰酶消化（避免长时间胰酶处理——可能切割 CD62L、CD44 等表面抗原）。
PBS 洗涤一次。300–400 × g，4 °C 离心 5 min。
用冷 FACS 缓冲液重悬。计数并调整至 1 × 10⁷ 细胞/mL。
每管/孔分装 100 µL（1 × 10⁶ 个细胞）。

全血

使用 EDTA 或肝素抗凝管采集血液。
每管分装 100 µL 全血。
直接向全血中加入抗体（见表面染色步骤 3）。
染色后加入 2 mL 红细胞裂解液。室温避光孵育 10 min。
350 × g 离心 5 min。弃去红色上清。FACS 缓冲液洗涤一次。

小鼠脾脏 / 淋巴结

将组织放在 70 µm 细胞滤器上（下方接 50 mL 离心管）。用注射器活塞轻柔研磨，冷 FACS 缓冲液冲洗。
用 10 mL 冷 FACS 缓冲液冲洗滤器。
400 × g，4 °C 离心 5 min。弃上清。
裂解红细胞：重悬于 2 mL 红细胞裂解液中，室温孵育 2–3 min。加入 10 mL FACS 缓冲液终止裂解。
离心，重悬，计数，按上述方法分装（每管 1 × 10⁶ 个细胞）。

3. 细胞表面染色方案

本方案适用于胞外标志物（CD 抗原、表面受体等）。除特别说明外，所有步骤均在 4 °C 或冰上进行。

步骤	操作	时间
1	活性染料（如使用可固定型）：将细胞沉淀重悬于 100 µL PBS（不含蛋白）中。按说明书加入可固定活性染料。避光孵育。	15–20 min，4 °C
2	洗涤：加入 2 mL FACS 缓冲液。300–400 × g，4 °C 离心 5 min。弃上清。	5 min
3	Fc 封闭：重悬于 50 µL FACS 缓冲液 + Fc 封闭剂（0.5–1 µg / 10⁶ 细胞）中。孵育。	10 min，4 °C
4	加入抗体：无需洗涤，直接加入经滴定优化的各直标抗体。轻柔混匀。避光孵育。	20–30 min，4 °C
5	洗涤：加入 2 mL FACS 缓冲液。300–400 × g，4 °C 离心 5 min。弃上清。重复洗涤一次。	10 min
6a	不固定直接上机：重悬于 200–500 µL FACS 缓冲液中。如未使用可固定型活性染料，上机前 5 min 加入 PI 或 7-AAD。1 小时内完成采集。	—
6b	固定后上机：重悬于 200 µL 2% PFA 中。4 °C 孵育 15–20 min。FACS 缓冲液洗涤一次。重悬于 200–500 µL FACS 缓冲液中。24–48 小时内采集（4 °C 避光保存）。	固定 15–20 min

串联染料注意事项：PE-Cy7、APC-Cy7 等串联荧光素对固定敏感。如需在表面染色后固定，请使用新鲜 PFA（不含甲醇），固定时间控制在 15 min 以内。延长固定时间或使用陈旧 PFA 会降解串联染料，导致信号减弱和溢出增加。

4. 胞内染色方案

胞内染色需要先固定再通透，使抗体穿过细胞膜。通透方法的选择取决于靶点类型：

靶点类型	方法	注意事项
细胞因子（IL-2、IFNγ、TNFα 等）	PFA 固定 + 0.1% 皂苷通透	皂苷形成可逆膜孔；后续所有洗涤/染色缓冲液中必须保持皂苷存在
磷酸化蛋白（pSTAT、pERK、pAKT 等）	PFA 固定 + 90% 冰冷甲醇	甲醇保留磷酸化状态。但会破坏 PE 和 APC——磷酸化检测方案中应使用 AF488、AF647 或小分子染料
核抗原（FoxP3、Ki-67、T-bet 等）	专用 FoxP3/转录因子染色缓冲液套装	商品化试剂盒专为核膜通透优化。请遵循生产商提供的方案。

胞内细胞因子染色（ICS）——分步操作

前提：先完成表面染色（第 3 部分步骤 1–5），暂不固定。

步骤	操作	时间
1	刺激（如检测诱导型细胞因子）：加入刺激剂（T 细胞：PMA 50 ng/mL + 离子霉素 500 ng/mL；单核细胞：LPS 1 µg/mL）及蛋白转运抑制剂（BFA 1× 或 Monensin 1×）。37 °C，5% CO₂ 培养。	4–6 小时
2	表面染色——按第 3 部分步骤 1–5 操作。	—
3	固定：重悬于 200 µL 4% PFA 中。孵育。	20 min，4 °C
4	洗涤：加入 2 mL FACS 缓冲液。400 × g 离心 5 min。弃上清。	5 min
5	通透：重悬于 200 µL 通透缓冲液（0.1% 皂苷 / FACS 缓冲液）中。孵育。	15 min，室温
6	胞内抗体：无需洗涤，直接向通透缓冲液中加入经滴定优化的胞内抗体。轻柔混匀。避光孵育。	30 min，室温
7	洗涤：加入 2 mL 通透缓冲液（非普通 FACS 缓冲液——必须保持皂苷存在）。400 × g 离心 5 min。重复一次。	10 min
8	重悬于 200–500 µL FACS 缓冲液中（此时无需皂苷——膜孔关闭，抗体被锁在胞内）。24 小时内完成采集。	—

磷酸化蛋白检测修改方案：将步骤 5–7 替换为：(5) 将固定后的细胞重悬于 1 mL 冰冷 90% 甲醇中。冰上孵育 30 min（或 −20 °C 过夜）。(6) 用 FACS 缓冲液洗涤两次以彻底去除甲醇。(7) 在 FACS 缓冲液中加入磷酸化特异性抗体，室温孵育 30–60 min。FACS 缓冲液洗涤两次。甲醇通透不可使用 PE 或 APC 标记的抗体——甲醇会使藻胆蛋白类荧光素变性。

5. 必要对照

对照类型	用途	适用场景
未染色细胞	确定基线自发荧光；设定阴性门	每次实验必需
单染补偿对照	计算通道间光谱溢出	每次多色实验必需。建议使用补偿微球（信号更亮、更均一）
FMO（Fluorescence Minus One）	通过显示其他通道的背景扩展来确定真阳性信号	推荐用于 ≥4 色方案。比同型对照更适合设门
同型对照	评估非特异性抗体结合（Fc 介导 + 疏水结合）	可选；胞内染色背景较高时有用。设门决策建议优先使用 FMO
活性对照	排除死细胞（死细胞非特异性结合抗体）	每次实验必需。热灭活细胞可作为活性染料的阳性对照
生物阳性对照	确认抗体能染色预期靶点	新抗体、新批次或新细胞类型时。使用已知表达靶点的细胞系

6. 抗体滴定：原理与方法

不经滴定直接使用数据表上的"推荐用量"是流式细胞术中最常见的错误。每种抗体克隆、荧光素、细胞类型和仪器的组合都有不同的最佳浓度。抗体过多会增加背景；过少则信号微弱。

快速滴定方案

配制抗体梯度稀释：例如每 10⁶ 个细胞加 5、2.5、1.25、0.625、0.3 µL。
用相同的细胞（相同数量、相同条件）分别与各稀释度染色。
在相同仪器设置下采集所有样品。
计算每个浓度的染色指数（Stain Index, SI）：SI = (MFI_阳性 − MFI_阴性) / (2 × SD_阴性)。
选择能达到接近最大 SI 值的最低浓度——这就是最优滴度。超过此浓度，增加抗体只会增加背景噪声。

7. 故障排除指南

问题	可能原因	解决方案
无染色 / 无信号	抗体未加入或加错管	标记所有管号；仔细核对试剂添加
	靶点不在此细胞类型上表达	设置已知阳性对照细胞
	激光/检测器配置错误	确认激发激光和发射滤片与荧光素匹配
	PE/APC 抗体曾被冻存	切勿冷冻藻胆蛋白类偶联物。弃用，使用新瓶
信号微弱	抗体未滴定，浓度非最优	进行滴定（第 6 部分）
	靶点低表达	换用更亮的荧光素（低表达靶点优先选 PE 或 APC）
	陈旧 PFA 导致串联染料降解	使用新鲜 PFA。考虑无甲醇固定缓冲液
高背景 / 非特异性染色	Fc 受体结合	在抗体染色前加入 Fc 封闭剂（步骤 3）
	死细胞非特异性结合抗体	加入活性染料并门控排除死细胞
	抗体浓度过高	向下滴定。更多抗体 ≠ 更强信号
阳性与阴性群体分离差	补偿设置不正确	重新运行单染补偿对照；重新计算补偿矩阵
阳性与阴性群体分离差	光谱相似的荧光素太多	重新设计方案以减少光谱重叠。使用 FMO 对照设门
FSC/SSC 散点图异常	细胞死亡或凋亡	使用新鲜细胞。样品保持冰上。尽量缩短收获到上机的间隔时间
FSC/SSC 散点图异常	细胞聚团	上机前立即通过 70 µm 滤器过滤。加入 EDTA（2 mM）或 DNase I 防止聚团
胞内染色正常但表面标志物丢失	甲醇通透剥离了表面抗体	务必在通透之前完成表面染色和固定。甲醇通透的正确顺序：表面染色 → PFA 固定 → 通透

8. 快速参考：荧光素-激光兼容性

确保荧光素与正确的激发激光匹配。下表涵盖标准 3–5 激光仪器的常见配置。

激光	波长	常用荧光素
紫色激光	405 nm	BV421、BV510、BV605、BV711、BV786、Pacific Blue、Zombie Aqua
蓝色激光	488 nm	FITC、AF488、PerCP、PerCP-Cy5.5、PI、7-AAD
黄绿激光	561 nm	PE、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-CF594、PE-Dazzle 594
红色激光	633/640 nm	APC、APC-Cy7、APC-Fire 750、AF647、AF700
紫外激光	355 nm	BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、Hoechst 33342

9. 多色方案设计实用技巧

亮荧光素 → 低表达靶点：将最亮的荧光素（PE、APC、BV421）分配给低表达抗原。将较暗的荧光素（FITC、PerCP-Cy5.5、AF700）分配给高表达抗原。
减少光谱重叠：避免在同一方案中搭配溢出严重的荧光素对（例如 FITC + PE 可以共用，但 PE-Cy7 + APC-Cy7 因共享串联接受体发射而有显著溢出）。
活性染料通道选择：选择不与方案中其他荧光素重叠的活性染料。当 BV 和 APC 通道已被占用时，Zombie Aqua（405/516）或 Zombie NIR（633/746）通常是好的选择。
每个设门决策都需要 FMO 对照：如果您需要在某个标志物的阳性和阴性之间画门，就需要该标志物的 FMO 对照。同型对照不足以在多色实验中准确设门。
先用对照验证方案：在使用珍贵样本之前，先用阳性对照细胞混合物验证完整方案（如 T 细胞方案可用刺激 + 未刺激的 PBMC）。

重组蛋白

抗体

试剂盒

实验相关试剂