流式检测中的自发荧光干扰：从Panel设计到结果判读

流式细胞术实验中，自发荧光可能影响阴性群体的分布、阳性群体的分辨度以及低表达Marker的检测结果。对于髓系细胞、组织来源细胞或具有GFP、RFP等荧光蛋白信号的样本，这一问题尤其值得关注。自发荧光的影响程度取决于样本自身的荧光特征、目标信号强度、检测通道、荧光染料组合及仪器配置。

实验结果中出现未预期的阳性群体、阴性群体分布变宽、弱阳性信号难以区分，或者不同细胞群在多个通道中呈现相似的荧光变化，这些现象都可能与自发荧光有关。

一、哪些荧光信号可能影响检测？

样本背景既可能来自细胞内源性荧光成分，也可能来自 GFP、RFP 等已有荧光蛋白。细胞类型、生理状态和处理条件都会影响背景强度及光谱分布，应以实际样本和仪器配置为判断依据。

图1. 不同自发荧光的发射光谱

因此，实验设计不应预先认定某种细胞类型必然具有较高背景，也不能仅凭某个通道的背景强度判断其是否适合使用特定染料。更重要的是评估目标细胞群在当前仪器各检测区域中的背景强度、分布宽度及群体间差异。

二、从流式结果中识别自发荧光干扰的线索

1. 阴性群体偏移、展宽或出现拖尾

先查看目标通道中未染色样本的直方图或散点图，再与完整染色样本比较。若未染色细胞已分布较宽、出现拖尾或延伸至预期阳性区域，背景可能参与了信号分布；若异常只出现在完整染色样本中，还需排查抗体染色、染料溢出和补偿等因素。

图2. 自发荧光导致阴性细胞群分布变宽

2. 不同细胞群在目标通道中的分布存在差异

在混合样本中，先依据散射特征和已有标记确定目标细胞群，再分别查看各群体的未染色分布。若异常集中于某一群体，后续评估应以该群体为准，避免用全样本分布代表所有细胞。

图3. 不同组织的自发荧光对实验结果的干扰（图中存在向右上角方向延伸的斜向拖尾，信号无法通过常规荧光补偿调节消除）

3. 同一细胞群在多个检测区域出现相关信号

若同一细胞群在多个检测区域同时表现为背景偏高或分布展宽，可排查跨波段的内源性荧光或 GFP/RFP 信号。这只是线索，仍需结合未染色样本、单色对照和仪器配置判断。

三、如何在Panel设计与实验调整中应对自发荧光干扰？

1. 根据背景分布确定染料分配

确定Panel前，可以使用与正式实验处理条件一致的未染色样本，观察目标细胞群在各检测区域中的背景分布，并关注阴性群体的分布宽度及不同细胞群之间的差异。

对于低表达Marker、稀有阳性群体或需要识别细微表达变化的指标，应优先考虑背景相对有利、信号分离度较好的检测组合。高表达Marker对染料亮度的要求通常相对较低，可根据整体Panel情况灵活分配，但需要评估其对其他检测区域的信号扩散影响。

对于表达GFP、RFP等荧光蛋白的样本，还应将已有荧光纳入Panel设计，评估其与候选抗体染料的光谱关系。染料选择需结合实际仪器配置、目标Marker的表达特点及整个Panel的信号关系，而不能仅依据染料亮度或发射峰判断。

例如，髓系细胞样本中若部分细胞群背景分布较宽，而目标低表达Marker的信号较弱，应优先保障该Marker的检测条件，再评估其他Marker的染料分配，避免信号扩散进一步降低目标群体的分离度。

图4. 淋巴细胞（红色）的自发荧光比粒细胞（蓝色）小

2. 根据实际检测表现调整方案

如果初步检测发现阴性群体明显展宽、弱阳性群体难以区分，应结合相应对照判断可能的干扰来源，再决定是否调整Panel。若目标检测区域受到样本背景的明显影响，可重新评估目标Marker的候选染料；若主要问题与其他染料的信号扩散有关，则可考虑调整相关Marker的染料分配。

传统流式细胞术的补偿用于校正不同荧光染料之间的光谱溢出，但不能消除细胞自身的自发荧光，也不一定能恢复已经降低的群体分离度。光谱流式，可以通过光谱拆分降低自发荧光对实验结果的影响。

调整的目标是改善关键细胞群的实际分离效果，而不是通过反复移动门控边界获得预期的阳性率。

图5：光谱流式利用光谱拆分降低自发荧光干扰

四、如何判断自发荧光是否影响了最终结果？

结果判读应聚焦目标细胞群和目标通道。未染色对照用于了解无抗体染料时的背景分布，但不能单独证明完整染色样本中的信号来自目标 Marker；GFP/RFP 样本也可用不加抗体染料的对照确认已有荧光范围。

FMO 对照保留除目标抗体染料外的其他染料，可评估背景和其他染料信号扩散对目标区域的共同影响，辅助判断弱阳性边界。FMO 不能排除抗体非特异性结合，也不能替代单色对照。应根据待回答的问题选择对照。

用相同门控策略识别目标细胞群，并排比较未染色对照、FMO 和完整染色样本。重点看阴性分布是否变宽、目标信号与背景是否仍有间距，以及重复样本中的群体位置和分离趋势是否一致。若门控边界稍变就导致阳性率大幅变化，应回到 Panel 设计排查。

对于 GFP/RFP 样本，应结合无抗体染料对照、单色对照及适用的 FMO 判断已有荧光是否影响目标检测。只有目标群体能与背景稳定分离且结果可重复时，阳性判定才较可靠；若调整染料后仍无法分离，应重新设计 Panel，而非反复移动门线。

结语

当样本有自发荧光时，评估应贯穿流式实验设计、检测和分析：先确定目标群体的背景分布，再按关键 Marker 的检测需求分配染料，最后通过适当对照确认分群可靠。对于背景复杂或表达 GFP/RFP 的样本，没有通用的固定搭配；关键是当前 Panel 能否在实际样本和仪器条件下稳定区分目标信号与背景。

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