免疫实验全拆解｜第1期 WB 实验你做对了吗？别再让条带“跑偏”！

引言

Western Blot (WB) 是许多科研人员在免疫学实验中的入门项目。虽然它的流程看似简单，但真正掌握这个技术、跑出高质量的结果，却是一个充满挑战的过程。条带偏移、背景过高、信号不明显……这些常见的问题你是否也遇到过？这些问题不仅影响实验结果的准确性，还会让你浪费宝贵的时间和试剂。

今天，我们不再只是讲理论，而是深入探讨 WB 实验中那些常见的“坑”，并给出如何有效避免的实操技巧。让你从根本上了解每一步，提升实验的可重复性和数据的可靠性。

什么是 WB（Western Blot）实验？

Western Blot 是一种经典的蛋白检测方法，广泛用于确认特定蛋白的存在及其相对表达量。其原理基于蛋白质的分子量分离和抗体特异性结合，主要步骤包括：

• 蛋白提取与定量：从细胞或组织样本中提取总蛋白，并使用BCA或Bradford法进行浓度测定；
• SDS-PAGE 电泳：通过加SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白变性并带上均匀负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中按分子量大小分离；
• 转膜：利用电场将分离后的蛋白从凝胶转移到PVDF或NC膜上，保留蛋白的空间分布；
• 抗体孵育：使用特异性一抗结合目标蛋白，再用标记有酶（如HRP）或荧光染料的二抗结合一抗，形成信号放大系统；
• 显色或发光检测：通过酶促反应（如ECL化学发光）或荧光信号，检测目标蛋白的位置和表达量。

WB的原理依赖于SDS-PAGE分离蛋白的能力以及抗体的特异性识别，确保对目标蛋白的精准检测。它是科研中不可或缺的技术之一，帮助分析蛋白表达水平、修饰状态及抗体特异性。通过优化操作，可获得高精度、可靠的实验数据。

条带总歪，是哪一步出问题了？

如果 WB 中的条带偏移，问题往往出在这些方面：

• 上样太多：上样量过多时，蛋白无法正确分离，导致条带“堆积”在一起，无法清晰呈现；
• 胶没聚好：如果电泳时胶的聚合不均匀，蛋白会跑得不均匀，导致条带形状扭曲；
• 转膜起泡：转膜过程中，如果膜上有气泡没有及时排出，蛋白转移不完全，条带可能出现断裂或模糊。

建议：

• 上样量控制在 20–30 μg，确保蛋白清晰分布；
• 确保胶聚合良好，可以通过反复检查胶的完整性来避免跑歪；
• 使用滚轴转膜，仔细确保没有气泡。

Fig.1.条带跑偏 vs 正常条带示意图

背景高，不一定是你“洗不干净”

高背景的 这个现象常常让人误以为是洗膜不彻底，但很多时候，真正的原因是：

• 抗体浓度太高：抗体浓度过高可能导致背景信号的增强，掩盖目标蛋白的真实信号；
• 封闭剂选择不当：如使用奶粉等封闭剂时，可能会干扰某些特定系统的信号；
• 二抗过度反应：二抗浓度过高，增强信号效果时可能产生过多背景。

建议：

• 一抗和二抗浓度一定要做预实验，不要仅凭感觉；
• 封闭剂选择 BSA，这种封闭剂对背景较低，且稳定性好；
• 曝光时，先拍一张长曝光图，从中找到最佳曝光时间。

Fig.2.背景模糊 vs 清晰图像对比图

信号弱 ≠ 抗体差

如果你遇到信号弱的情况，可能并不是抗体的问题，可能是这些方面没有注意到：

• 一抗浓度过低：一抗浓度过低时，靶标蛋白信号可能被忽视，导致条带弱；
• 转膜失败：如果转膜没有完成，蛋白就无法从凝胶成功转移到膜上，信号自然也无法显现；
• 曝光时间不够：曝光时间过短，可能导致信号没有充分显现。

建议：

• 确保 PVDF 膜提前活化，有助于提高膜的吸附性；
• 转膜的电压和时间根据目标蛋白的分子量进行匹配；
• 曝光前拍一张长曝光的“预判图”，找到最合适的信号范围。

Fig.3.梯度稀释 WB 条带图

有些细节，没注意就容易出错

以下是一些容易被忽略的细节，可能会直接影响实验结果：

• 目标蛋白的表达量：如果目标蛋白是低表达型，需要通过富集或延长曝光时间来增强信号；
• 识别天然构象还是变性蛋白：Western Blot 只适合变性蛋白的识别；
• 膜的选择：PVDF 膜对于较大分子量蛋白的转膜效果更好，而 NC 膜适用于一些低分子量蛋白。

总结一句话

Western Blot 实验没有一个“标准答案”，每一个环节的优化都能让结果更清晰。通过细化每一个步骤，优化抗体浓度、转膜时间等因素，你可以逐步获得稳定且可重复的实验结果。

下一期预告

《免疫实验全拆解｜第2期：IHC 染出来的图，真的可信吗？》

组织背景过深？信号不清楚？自发荧光干扰大？我们将带你一步步拆解免疫组化实验中的“误区”，敬请期待！