Western Blot 常见问题与解决方案：蛋白质分析实验优化指南

Western blot (WB)，或称免疫印迹，是结合抗体特异性与电泳蛋白分离技术的一种方法。广泛用于细胞裂解物或组织提取物中蛋白质的定性、定量和鉴定分析。然而，WB 容易受到技术缺陷的影响，常常需要进行故障排除以确保准确性和可靠性。

以下是 Western Blot 常见问题的详细概述及实用解决方案。

1. 高背景信号

- 初级抗体浓度过高—稀释以减少非特异性结合。

- 孵育温度过高—在 4°C 下过夜孵育以提高特异性。

- 封闭不充分—更换封闭试剂或延长封闭时间。

- 曝光过度—减少曝光时间以避免信号饱和。

- 二级抗体浓度过高—优化稀释倍数。

高背景信号

2. 条带模糊

- 蛋白加载不均—标准化样本浓度。

- 转膜问题—根据蛋白质大小优化时间和电压。

- 抗体结合弱—在 4°C 下过夜孵育初级抗体。

- 抗体不兼容—确保宿主物种配对正确。

- 凝胶过热—使用冷却系统或降低电泳电压。

条带模糊

3. 条带缺失

- 蛋白表达量低—加入高表达阳性对照。

- 检测灵敏度低—增加样本加载量并使用蛋白酶抑制剂。

- 储存不当—保持样本低温以防止降解。

- 抗体错误—验证物种和同工型识别。

- 初级抗体不足—滴定至最佳浓度。

4. 条带不清晰或不规则

- 凝胶混合不均—在浇注凝胶前充分混合。

- 样品孔变形—移除梳子时避免损坏样品孔。

- 缓冲液过期—始终使用新鲜的运行和转膜缓冲液。

- 气泡或碎屑—检查对齐并在转膜前清洁凝胶。

- 转膜缓冲液不足—确保凝胶和膜完全浸没。

- 高盐样本—考虑在加载前脱盐。

- 仪器老化—更换海绵并确保紧密接触。

5. 非特异性条带

- 翻译后修饰—多个条带可能反映修饰。

- 替代同工型—查阅文献或生物信息学工具。

- 蛋白降解—加入蛋白酶抑制剂并保持样本在冰上。

- 样本过载—减少蛋白质量。

- 抗体浓度高—滴定初级和二级抗体。

- 抗体特异性差—选择经过验证的特异性抗体。

- 孵育时间过长—减少孵育或曝光时间。

6. 条带强度不均

- 抗体结合效率差异—优化抗体浓度和时间。

- 蛋白输入不均—确保提取和定量一致。

7. 条带中出现白点

- 底物耗尽—降低抗体/蛋白浓度或快速成像。

- 气泡—避免在转膜过程中捕获气泡。

8. 膜上出现黑点

- 封闭试剂未完全溶解—充分溶解奶粉并彻底洗涤。

- 使用含奶的缓冲液稀释抗体时需同样小心。

9. 条带拖尾

- 蛋白过量—降低样本加载量。

- 抗体浓度高—适当滴定。

- 孵育时间过长—缩短并优化孵育时间。

10. “笑脸”条带

- 电泳过快—降低电压。

- 凝胶过热—在冷室或冰上进行电泳。

11. “哭脸”条带

- 凝胶浇注不良—去除气泡并确保均匀聚合。

12. 哑铃形条带

- 凝胶不均—重新浇注并确保均匀聚合。

- 样本杂质—离心样本以去除碎屑。

13. 条带重叠

- 过载—减少样本体积。

- 凝胶接口不良—确保堆积凝胶和分离凝胶之间紧密密封。

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