B细胞解决方案 B cell Panel

B细胞（B淋巴细胞）是适应性免疫系统的关键组成部分，具有生成高亲和力抗体、建立免疫记忆、充当抗原呈递细胞（APC）以及分泌细胞因子（如CCL22、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α）等多种功能。记忆B细胞和浆细胞分别负责长期免疫保护和抗体分泌（如IgM、IgG、IgE）。B细胞起源于骨髓中的造血干细胞（HSCs），在骨髓完成早期发育后迁移至外周淋巴器官（如脾脏、淋巴结），通过抗原刺激进一步成熟为效应细胞。虽然大多数B细胞寿命较短，但记忆B细胞可存活数年甚至终生，确保对再次感染的快速反应。

B细胞发育分为多个阶段，主要在骨髓和次级淋巴器官（SLO）中完成，其命运由特定基因的表达调控，可通过流式细胞术检测表面和胞内标志物进行分型。

Fig 1. B-cell development and B-cell subsets

Fig 2. B cell developmental stages in the bone marrow（DOI: 10.7554/eLife.53557）

B细胞分型标志物

CD19是B细胞发育过程中的核心标志物（在浆细胞阶段表达降低），结合其他标记物可区分各亚群。以下为人和小鼠B细胞分型的关键标志物，适用于流式分析。

B细胞分泌的细胞因子

B细胞流式检测操作步骤

流式细胞术是分析B细胞亚群和功能的金标准技术。以下为优化后的完整操作流程，确保高灵敏度和特异性。

• 1. 样品准备
  • 样本收集：从外周血（EDTA抗凝管）、骨髓或淋巴组织（脾脏、淋巴结）提取单细胞悬液。组织样本需用胶原酶或机械研磨制备。
  • 红细胞裂解：外周血样本用1×红细胞裂解液（用蒸馏水或去离子水稀释原液）处理5-10分钟，400g离心5分钟，弃上清。
  • 洗涤：用PBS + 2% FBS洗涤2次，400g离心5分钟，去除残留碎片。
  • 计数与调整：用血细胞计数板或自动计数仪调整细胞浓度至1-2×10^6 cells/mL。
  • Fc阻断：加入Fc受体阻断剂（如Human Fc Block或Mouse CD16/CD32抗体，货号：FMK25210），4°C孵育10分钟，减少非特异性结合。
• 2. 抗体标记
  • 抗体选择：根据实验目标选择荧光抗体，如CD19（Pan B）、CD20（成熟B）、CD27（记忆B）、CD138（浆细胞）、IgM/IgD（发育阶段）。推荐预先滴定抗体浓度。
  • 孵育：每10^6细胞加入1-5 µL抗体（100 µL体积），4°C避光孵育20-30分钟。
  • 洗涤：加1-2 mL流式缓冲液（PBS + 2% FBS），400g离心5分钟，弃上清，重复2次。
• 3. 染色与固定（可选）
  • 死细胞排除：加入7-AAD或PI（浓度依说明书），室温孵育5分钟，区分活细胞。
  • 胞内染色：检测细胞因子（如IL-10）或转录因子时：
    • 固定：4%多聚甲醛，10分钟，400g离心。
    • 通透：0.1% Triton X-100，5分钟。
    • 标记：加入胞内抗体，4°C孵育30分钟，洗涤2次。
• 4. 数据采集
  • 仪器设置：匹配荧光团与激光器（如FITC用488 nm，APC用633 nm），调整PMT电压。
  • 对照：设置未染色、单染和同型对照，用于补偿和特异性验证。
  • 上机：转移至流式管，采集10,000-50,000个事件，流速控制在200-500 events/s。
  • 门控：FSC/SSC圈定淋巴细胞，CD19+筛选B细胞，再细分亚群（如CD27+CD38-为记忆B细胞）。
• 5. 数据分析
  • 软件：用FlowJo或Cytobank导入FCS文件。
  • 门控策略：从淋巴细胞门到CD19+ B细胞门，再根据CD20、CD27、CD138等分型。
  • 补偿：基于单染对照调整荧光溢出。
  • 输出：生成散点图、直方图，计算亚群比例和MFI。

注意事项

• 全程避光操作，避免荧光猝灭。
• 样品制备后2小时内上机，防止细胞凋亡。
• 使用滤网（40-70 µm）去除团聚细胞。
• 定期校准流式仪，确保数据一致性。

流式抗体推荐

参考文献

[1] Monzón-Casanova, Elisa et al. “Polypyrimidine tract-binding proteins are essential for B cell development.” eLife vol. 9 e53557. 21 Feb. 2020, doi:10.7554/eLife.53557