巨噬细胞解决方案 Macrophages cell Panel

巨噬细胞是先天免疫系统的核心效应细胞，具有吞噬病原体、清除凋亡细胞及调控免疫反应的多重功能。1882年，Elia Metchnikoff首次发现其吞噬作用并命名。巨噬细胞主要来源于骨髓中的单核细胞（Monocytes），这些单核细胞进入血液后迁移至组织，分化为驻留型巨噬细胞，如肝脏中的库普弗细胞（Kupffer Cells）、肺泡巨噬细胞（Alveolar Macrophages）和脑部的微胶质细胞（Microglia）。巨噬细胞不仅清除病原体和细胞碎片，还通过分泌细胞因子（如TNF-α、IL-6）和趋化因子（如CCL2）协调免疫反应。根据微环境信号，巨噬细胞可极化为M1型（促炎型）或M2型（抗炎型）。M1型通过促炎因子（如IL-12、IL-23）驱动抗菌和抗肿瘤免疫，而M2型通过IL-10、TGF-β等促进组织修复和免疫抑制。巨噬细胞在感染、肿瘤、自身免疫病及组织稳态中发挥关键作用，其表型和功能随细胞因子、代谢状态及组织微环境动态变化。

Fig 1. Origin of tissue-resident macrophages: bone marrow-originated monocytes (DOI: 10.1016/j.jconrel.2015.12.014)

巨噬细胞的分类与活化

巨噬细胞的表型分类具有高度异质性，受信号分子（LPS、IFN-γ）、生长因子（M-CSF、GM-CSF）、转录因子（STAT1、IRF4）及代谢状态（如氧化代谢 vs. 糖酵解）调控。M1型巨噬细胞由IFN-γ和LPS诱导，表达高水平iNOS（诱导型一氧化氮合酶）和促炎因子，在急性感染和肿瘤微环境中占主导；M2型巨噬细胞由IL-4、IL-13或免疫复合物诱导，表达Arg1（精氨酸酶1）、CD206等，参与慢性炎症消退和组织修复。M2型进一步细分为M2a（IL-4驱动，抗寄生虫）、M2b（免疫调节）和M2c（IL-10驱动，组织重塑）。巨噬细胞的动态极化在免疫监视、炎症调控及疾病进程中至关重要，尤其在肿瘤微环境中，M2型常促进肿瘤生长，而M1型抑制肿瘤进展。

Fig 2. M1 and M2 macrophages in tumor regulation, with M1 inhibiting and M2 promoting tumor growth (DOI: 10.1007/s00262-020-02781-8)

巨噬细胞流式检测完整流程

流式细胞术是分析巨噬细胞亚群及其功能状态的金标准技术。以下为优化后的操作流程，确保高灵敏度和特异性。

• 1. 样本准备
  • 样本收集：从外周血（EDTA抗凝管）、组织（脾脏、肺、肝脏）或体液（腹水、肺泡灌洗液）获取细胞。组织样本需机械研磨或酶消化（胶原酶IV + DNase I，37°C，30-60分钟）制备单细胞悬液；外周血用Ficoll密度梯度离心分离PBMC。
  • 红细胞裂解：外周血或组织样本用1×红细胞裂解液（蒸馏水稀释）处理5-10分钟，400g离心5分钟，弃上清。
  • 洗涤：用PBS + 2% FBS洗涤2次，400g离心5分钟，去除残留碎片。
  • 计数与调整：用血细胞计数仪调整浓度至1-2×10⁶ cells/mL（100 µL/管）。
  • Fc阻断：加入Fc受体阻断剂（如Mouse CD16/CD32抗体，货号：FMK25210，或Human Fc Block），4°C孵育10分钟，减少非特异性结合。
• 2. 抗体标记
  • 抗体选择：人巨噬细胞常用CD11b、CD68、CD14（单核来源）、CD163/CD206（M2型）、CD80/CD86（M1型）；小鼠用F4/80、CD11b、CD206、CD80。建议预先滴定抗体浓度。
  • 孵育：每10⁶细胞加入1-5 µL抗体（100 µL体积），4°C避光孵育30分钟。
  • 洗涤：加1-2 mL流式缓冲液（PBS + 2% FBS），400g离心5分钟，弃上清，重复2次。
• 3. 染色与固定（可选）
  • 死细胞排除：加入7-AAD或PI（按说明书浓度），室温孵育5分钟，区分活细胞。
  • 胞内染色：检测iNOS（M1）、Arg1（M2）或细胞因子（如TNF-α、IL-10）时：
    • 固定：4%多聚甲醛，10分钟，400g离心。
    • 通透：0.1% Triton X-100，5分钟。
    • 标记：加入胞内抗体，4°C孵育30分钟，洗涤2次。
• 4. 数据采集
  • 仪器设置：匹配荧光团与激光器（如FITC用488 nm，APC用633 nm），调整PMT电压。
  • 对照：设置未染色、单染和同型对照，用于补偿和特异性验证。
  • 上机：转移至流式管，采集50,000-100,000个事件，流速控制在200-500 events/s。
  • 门控：FSC/SSC圈定单核/巨噬细胞群，结合特异性标志物（如F4/80+CD11b+）筛选。
• 5. 数据分析与特定亚群分析
  • 软件：用FlowJo或Cytobank导入FCS文件。
  • 门控策略：
    • 总单核细胞门：FSC/SSC散点图圈定单核/巨噬细胞群，排除碎片。
    • 活细胞门：用7-AAD⁻排除死细胞。
    • 巨噬细胞门：人用CD11b⁺CD68⁺或CD14⁺筛选，小鼠用F4/80⁺CD11b⁺。
    • 特定亚群分析：
      • M1型巨噬细胞：在巨噬细胞门中，筛选CD80⁺CD86⁺细胞，可结合iNOS或TNF-α胞内染色验证促炎状态。
      • M2型巨噬细胞：在巨噬细胞门中，筛选CD206⁺CD163⁺（人）或CD206⁺（小鼠）细胞，可结合Arg1或IL-10染色确认抗炎功能。
      • 驻留型巨噬细胞：如肺泡巨噬细胞（小鼠：F4/80⁺CD11c⁺SiglecF⁺），需根据组织特异性标志物调整（如肝脏用CD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁻）。
  • 荧光补偿：基于单染对照调整荧光溢出。
  • 结果解读：
    • M1型比例升高：提示急性感染或抗肿瘤免疫激活。
    • M2型占主导：常见于慢性炎症、组织修复或肿瘤促进微环境。
    • CD80/CD206表达变化：高CD80提示促炎，低CD206提示M1极化，反之则倾向M2。
    • 组织特异性巨噬细胞：如肺泡巨噬细胞比例异常可能与肺纤维化相关。
  • 输出：生成散点图（如CD80 vs. CD206）、直方图，计算亚群比例和MFI。

注意事项

• 全程避光操作，避免荧光猝灭。
• 样本制备后2小时内上机，防止细胞凋亡影响表型。
• 用40-70 µm滤网去除团聚细胞，确保单细胞悬液。
• 定期校准流式仪，保证数据一致性。

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参考文献

[1] Pei, Yihua, and Yoon Yeo. “Drug delivery to macrophages: Challenges and opportunities.” Journal of Controlled Release vol. 240 (2016): 202-211. DOI: 10.1016/j.jconrel.2015.12.014
[2] Wang, Yi, et al. “M1 and M2 macrophage polarization in tumor regulation.” Cancer Immunology, Immunotherapy vol. 70 (2021): 1-12. DOI: 10.1007/s00262-020-02781-8