CD9+外泌体为唾液腺纤维化打开细胞外疗法新路径

化学重编程扩增唾液腺祖细胞

首先，研究人员从人类腮腺中分离出唾液腺基底祖细胞（sgBPCs），并通过三种小分子的组合（ROCK抑制剂、TGFβ抑制剂与BMP抑制剂）构建了一种化学重编程体系，这一体系不仅可以维持sgBPCs的上皮性特征，还使其可以在体外持续扩增超过50代，同时保留分化潜能。免疫染色显示它们Jonah Hill它们高度表达KRT5、KRT14、SOX9等基底细胞标志，几乎不表达终末分化标志KRT7和SOX2，说明其确为未分化状态。而在3D基质中，这些细胞能组装形成腺样结构，并分化出上皮细胞谱系，进一步确认其干性。这一体系成功提供了一个既稳定、又功能强大的外泌体“工厂”。

Fig.1 SgBPCs从人类腮腺中分离的示意图

利用微流控芯片从sgBPC中提取高纯度CD9⁺ EVs

接下来，研究人员聚焦于如何从这一“工厂”中挑选出最有用的产品。根据单细胞转录组数据发现，唾液腺上皮细胞中，CD9这一膜蛋白在基底细胞中特异性高表达，而CD63和CD81则主要出现在非上皮细胞中。启发研究人员开发了一套基于CD9抗体的微流控分选系统，通过芯片上的亲和捕获结构，仅用20分钟即可高纯度分离出CD9阳性的EV（CD9⁺ EVs）。

Fig.2 微流体设备原理示意图

检测显示，这类EV粒径分布集中、纯度高、CD9表达占比达58.5%，且在冷冻保存6个月后依然保持形态完整、表面电荷稳定。这一成果不仅展示了精准提取EV的技术可行性，也为后续功能验证奠定基础。

Fig.3 CD9⁺ EVS上CD9、CD81和CD63的表达及储存六个月后的活性

CD9⁺ EVs较其他EVs更易被摄取，富含再生相关蛋白

有了稳定的来源与可靠的分选手段，研究者开始探究这些CD9⁺ EV是否能符合预期效果。首先在摄取实验中，他们发现CD9⁺ EVs更容易被唾液腺上皮细胞摄入，摄取量远高于CD9⁻ EVs与混合EV组。质谱分析显示，CD9⁺ EVs富含多种与膜融合、细胞黏附和组织修复相关的蛋白，如TSPAN4、CD81、CD82和整合素ITGA3/ITGB1，这些都是细胞外通讯和修复过程中不可或缺的信号元件。

Fig.4 唾液上皮细胞对CD9⁺外泌体摄取实验结果及CD9蛋白质互作网络

特别值得注意的是，CD9与CD44这一上皮常见的粘附分子有直接的互作关系，这可能解释了其被靶细胞高效摄取的原因。相比之下，CD9⁻ EVs则更多携带与免疫趋化相关的内容物，其功能指向并不适合组织再生。

CD9⁺ EV在小鼠纤维化模型中逆转组织损伤

为探究CD9⁺ EVs是否真的能在体内发挥作用，研究人员建立了小鼠唾液腺导管阻断模型，通过持续14天的结扎诱导出严重的纤维化改变。然后将EVs通过导管局部注射至腺体内。

Fig.5 小鼠唾液腺导管阻断模型

结果令人振奋：与PBS和CD9⁻ EV组相比，CD9⁺ EV处理组小鼠在唾液分泌速度、起效时间、腺体重量恢复等指标上均显著改善。组织学染色（H&E、PAS）显示，其腺泡与导管结构恢复更好；MTC与Sirius Red染色显示，胶原沉积显著减少，纤维化程度大幅缓解。更令人惊喜的是，即便这些CD9⁺ EVs提前冷冻保存达6个月后再注射，依然保有明显疗效，说明其稳定性极佳，具备临床应用潜力。

作用机制探究：CD9⁺ EVs抑制EMT、促进祖细胞增殖

为了理解其作用机制，作者进一步观察了上皮细胞的变化，发现CD9⁺ EV处理组中，祖细胞与成熟腺泡细胞的标志物表达恢复，细胞增殖显著增强，而EMT（上皮-间充质转化）相关标志如CDH2、VIM、SLUG、TWIST1均被抑制。也就是说，CD9⁺ EVs不仅促进了功能性上皮细胞的增殖与分化，还有效抑制了纤维化进程。

为进一步明确信号传导机制，研究者在体外类器官模型中开展了验证实验。使用Activin A诱导唾液腺类器官发生纤维化转变，然后分别加入CD9^- EVs、CD9⁺ EVs与阳性对照地塞米松治疗。结果显示：CD9⁺ EVs比其他组更能显著恢复类器官的结构与功能，qPCR显示其能下调多种纤维化基因如COL1A1、SNAI1，并恢复分泌标志。更关键的突破在于，miRNA测序显示CD9⁺ EVs特异性富含miR-3162与miR-1290，这两种miRNA均可直接靶向ACVR1（一种Activin受体），从而阻断SMAD2/3磷酸化这一关键纤维化通路。报告基因实验证实了这一作用轴的确切存在，机制闭环至此完全建立。

Fig.8 类器官模型实验结果

本研究围绕细胞外囊泡的治疗潜力，构建了一条具有高度逻辑性与实践可行性的研究路径。从基础细胞建立，到精准提纯技术开发，再到体内外功效验证与机制揭示，系统性地阐明了细胞外囊泡在抗纤维化治疗中的作用。最终研究结果表明，CD9⁺ EVs不仅具备规模化制备与低温保存的技术优势，更展现出良好的生物活性与临床转化潜力，进一步印证了“选择合适的信号载体，传递有效的生物信息”在再生医学领域的重要意义。

CD9是一种广泛表达于多种细胞类型表面的四次跨膜蛋白，属于四跨膜蛋白家族（tetraspanin family）。它在细胞间信号传导、细胞粘附、迁移和融合等多种生物过程中发挥着关键作用。约由228个氨基酸组成，包含四个跨膜区、两个细胞外环（大环和小环）以及细胞内尾部。它高度保守且在免疫细胞、上皮细胞、血小板及多种肿瘤细胞中均有表达，主要功能包括：

• 促进细胞与细胞、细胞与基质的粘附和相互作用
• 调控细胞迁移和组织重塑
• 参与细胞融合过程
• 作为细胞外囊泡的标志蛋白，介导EV的形成和信息传递

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