CD45靶向抗体偶联物为β-珠蛋白病提供非化疗预处理方案

         β- 珠蛋白疾病（包括镰状细胞病（SCD）和 β-地中海贫血）是全球发病率最高的单基因遗传性疾病，其核心病理在于β-珠蛋白合成缺陷或结构异常。现有获批药物（如busulfan）疗效有限且需终身服用，而异基因造血干细胞（HSC）移植虽为治愈手段，但受限于供体匹配。虽然胎儿期的γ-珠蛋白（HbF）可部分或完全替代β-珠蛋白功能，缓解临床症状，但HbF在出生后迅速下调。如何稳定激活HbF表达，成为当前基因治疗的重要方向。

         BCL11A是调控γ-珠蛋白表达的关键转录因子，其在红系细胞中特异性表达受BCL11A内含子2中+58、+55和+62三个增强子控制。其中+58位点已被证实是最有效的靶点，当前临床试验亦聚焦于该位点的基因编辑。然而，由于个体间应答差异大，单一位点编辑可能难以实现理想的长期疗效。因此，本研究提出：同时靶向+58与+55增强子，能否实现更高效、更持久的HbF诱导？并探索以CD45抗体-药物偶联物（ADC）替代传统化疗作为移植前预处理手段的可行性。

1. BCL11A +55/+58联合增强子编辑可高效诱导HbF并长期稳定植入

         研究首先聚焦于BCL11A的+58和+55增强子，两个调控HbF表达的关键区域。此前已有研究表明+58是最有效的单点，但HbF应答仍存在个体差异。为进一步增强疗效，研究者构建了三组CRISPR-Cas9编辑方案：分别靶向+58、+55，以及+58和+55双靶点联合编辑。在猴源CD34⁺造血干/祖细胞中进行体外编辑后发现，联合编辑组的HbF表达水平显著高于任一单点组，且不会影响细胞活力或红系分化能力，验证了双靶点协同破坏更有效释放γ-珠蛋白表达的假设。

         为了验证编辑细胞的体内表现，研究团队将经过联合编辑的自体CD34+细胞输注回预先接受busulfan处理的恒河猴体内，随后开展为期4年的长期追踪。结果显示，编辑细胞在多种血液细胞谱系中稳定存在，包括粒细胞、T细胞、B细胞和骨髓造血干细胞等，无异常分化或毒性迹象。HbF水平在术后第2个月达到高峰后稳定维持，体现出长期、可控的γ-珠蛋白表达。

2. 放血和羟基脲（HU）可进一步增强HbF水平

         研究团队接着模拟“临床中可能用到的加强策略”，在HbF稳定表达后，通过放血（诱导应激性红系生成）和羟基脲（HU）（FDA 批准的 HbF 诱导药物）给药进行干预。结果发现，编辑过的动物在接受放血或HU治疗后，HbF水平明显再次升高，而未编辑对照动物无明显反应。这说明BCL11A增强子编辑后，红细胞对γ-珠蛋白诱导机制变得更加敏感，为后期治疗调控提供了灵活空间。此外，即使不进行放血，单用HU也能显著提升HbF，提示其在非应激状态下依然具有增强效果。

Figure 4. 应激造血可显著提升F细胞比例和γ-珠蛋白水平，对照组无显著变化。

3. 联合编辑后主要诱导的是有目的、机制明确的“优质”突变

         研究者还深入分析了编辑的类型和质量，明确评估哪些突变真正有效。通过对移植前与移植后细胞进行ddPCR和深度测序，发现多数编辑属于程序化的3.1 kb缺失或倒位，精准破坏+55和+58增强子的核心GATA1结合位点，是有效靶向的理想结果；非计划性长片段缺失或复杂重排在移植前细胞中比例较高，但在体内几乎不见（<2.2%），说明这类“异常编辑”不具备长期造血能力，在体内自然被淘汰，增强了策略的可预期性。

Figure 5. 联合编辑+58和+55增强子破坏了恒河猴CD34⁺HSPC植入细胞中的关键GATA结合位点。

4. 编辑过程具有良好的脱靶安全性

         编辑技术最怕“误伤”。因此，研究还使用了CIRCLE-seq+深度测序，系统检测了+55与+58靶向sgRNA在灵长类基因组内的潜在脱靶位点。在所有动物体内外采样中，只有一个位点（OT9）在极低频率（<0.24%）接近检测下限处偶有检测，且无扩增趋势，其余候选位点未发现脱靶编辑，具有良好的生物安全性。

Figure 6. 联合编辑+58和+55增强子后移植的CD34⁺ HSPCs在体内未检测到非靶标活性。

5. CD45抗体-药物偶联物（CD45-ADC）预处理可替代传统化疗实现高效植入

         传统的busulfan虽然有效，但毒性大，限制了基因治疗的推广。因此，研究尝试用CD45抗体-药物偶联物（CD45-ADC）作为“靶向型清髓”手段，进行干细胞移植前的预处理。在猴模型中，单次CD45-ADC预处理即可实现有效的骨髓空间清除，使后续编辑细胞成功植入，并达到与busulfan组相当甚至更高的HbF表达水平和克隆多样性。这一策略显著减少了毒副作用，是极具潜力的“无化疗”基因治疗新方向。

Figure 7. 经CD45-ADC预处理后，移植联合编辑BCL11A增强子的自体CD34+细胞，恒河猴体内保持高编辑率并显著上调Y球蛋白。

         从体外编辑、长期植入，到药物增强与预处理替代，本研究全面验证了双增强子靶向+非化疗预处理在灵长类动物中实现长期、安全、高效HbF重激活的可行性，为β-地中海贫血与镰状细胞病等血红蛋白病的根治提供了坚实的技术基础。

本文靶点盘点：

BCL11A：HbF表达的关键抑制因子

BCL11A（B-cell leukemia/lymphoma 11A）是一种锌指转录因子，在造血系统中发挥重要调控作用，尤其在胎儿期至成人期的血红蛋白转换过程中，是抑制γ-珠蛋白（HbF）表达的关键因子。在红系细胞中特异性高表达，主要通过与HbF启动子区域结合或招募染色质重塑复合物，下调γ-globin基因的转录。

近年来的研究明确指出，BCL11A在红系细胞中的表达受其第二内含子内的多个增强子元件调控，尤以+58位点活性最强、+55次之。靶向这些增强子区域可实现红系特异的BCL11A表达抑制，从而解除对HbF的抑制而非全身性失活，有效降低脱靶风险。相关临床试验已采用CRISPR或shRNA等方式靶向BCL11A增强子进行干预治疗，如Vertex/CRISPR Therapeutics公司开发的 exa-cel（CTX001）方案，已取得治疗镰状细胞病和β-地中海贫血的积极结果。

CD45：用于非化疗清髓的靶向分子

CD45（也称PTPRC）是表达于所有白细胞表面的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，是免疫细胞发育和信号转导中不可或缺的分子。由于其广泛表达于造血干/祖细胞、淋巴细胞和髓系细胞，成为靶向清除骨髓造血系统细胞的理想分子靶点。本研究所使用的 CD45抗体偶联物（CD45-ADC），将抗CD45抗体与细胞毒素PBD二聚体结合，实现对CD45⁺细胞的精准杀伤，避免传统化疗带来的非特异性毒性（如脱发、不育、DNA损伤等）。相比化疗，CD45-ADC展示出更好的特异性、更低的副作用和更可控的剂量依赖性，已在多项人源化小鼠与非人灵长类模型中验证其清髓能力。

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