流式结果总被干扰？可能是你的红细胞没“裂”好！

流式结果总被干扰？可能是你的红细胞没“裂”好！

在做外周血或组织单细胞悬液的流式检测时，红细胞（RBC）往往是“隐形的麻烦制造者”。它们数量庞大、体积小、无核且不携带目标免疫表位，容易掩盖白细胞信号、增加背景、干扰门控，甚至在染色、测定绝对计数时造成误判。因此，去除红细胞是获得干净、可重复流式结果的第一步。实验室常用去除红细胞的方法是用红细胞裂解液（Red Blood Cell Lysis Buffer，亦称 ACK Lysis Buffer）裂解样本中的红细胞。

1. 红细胞裂解液常规配方及裂解原理

表1：1×ACK lysis buffer

按照上表取NH₄Cl 4.16 g、KHCO₃ 0.5 g、Na₂EDTA 0.02 g溶于100 mL去离子水中，调节pH至7.2，然后补充去离子水至500 mL。4℃储存，使用时恢复至室温。

红细胞裂解液的核心成分是氯化铵。在裂解过程中，氨根离子（NH₄⁺）无法通过细胞膜，而其他离子（如氯离子 Cl⁻）可以自由通过。这种选择性通透性导致细胞内外离子浓度差异，形成渗透压差。外部的水分会因渗透压差扩散至细胞内，使红细胞膨胀直至破裂，从而实现裂解效果。而有核细胞由于细胞膜结构和成分的差异，对裂解液的耐受性更强，不会受到损伤，从而实现红细胞与有核细胞的有效分离。

2. 红细胞裂解实验操作流程

1）血液样本

①取100 μL新鲜抗凝血与离心管中，按照1:10-1:20的比例加入红细胞裂解液，混匀。

②室温或4℃裂解5-10 min，血液样本开始变透明。

③300-500×g离心5 min，用移液器小心吸弃上清。（如发现红细胞裂解不完全，可重复步骤①和步骤②依次，通常极微量的红细胞对后续实验影响较小）

④洗涤，加入2-5 mL的PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，300-500×g离心2-3 min，弃上清。

⑤根据后续实验需要用适当溶液重悬细胞。

2）组织样本

①新鲜组织经胰酶或胶原酶等消化分散成单个细胞悬液，离心弃上清。

②按 1:3-1:10的比例向细胞沉淀中加入裂解液，轻轻吹打混匀，裂解3-5 min。（具体时间需根据裂红效果来决定）

③加入5-10倍体积的PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液终止裂解。

④300-500×g离心5 min，弃上清。

⑤根据后续实验需要用适当溶液重悬细胞。

3.红细胞裂解常见问题

1)如何判断裂解效果

   ①直接观察：裂解完全后溶液的颜色变清澈透明，如图1所示

图1. 红细胞裂解不全（左）VS红细胞裂解完全（右）

 ②上机检测：裂解完全的样本上机后细胞分群明显，如图2所示

图2. 红细胞裂解完全（ab）VS红细胞裂解不全（cd）上机效果展示（图片来源于网络）

2)红细胞裂解效果不佳

3)为什么小鼠&大鼠红细胞比较难裂解？

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