abinScience助力陆军军医大学团队完成黄芩素雷帕霉素自组装纳米平台靶向机制研究

Figure 1. ABRNPs的构造示意图及其针对CIRI的治疗机理

01黄芩素与雷帕霉素自组装纳米粒的构建

研究起点是黄芩素（Baicalein, BLN，一种从中药黄芩中提取的天然黄酮类自由基清除剂）和雷帕霉素（Rapamycin, RAP，mTOR抑制剂/免疫抑制剂）。研究者比较了不同摩尔比下两者的自组装效果，确定1:1为最优配方（粒径134 nm，PDI 0.19，均为各比例中最优），命名为BR NPs。分子动力学模拟显示BLN与RAP通过氢键和范德华力形成稳定纳米聚集体，TEM证实其呈规则球形。随后用DSPE-PEG2k-Angiopep-2对BR NPs进行表面修饰，得到具备血脑屏障穿越和神经细胞靶向能力的ABR NPs（粒径138.5 nm，Zeta电位-40.53 mV，Figure 1C-D）。总载药量约77% w/w，远高于传统纳米载体（通常<20%）。

Figure 2. BLN与RAP自组装为球形纳米粒，并经Angiopep-2修饰得到ABR NPs

02PEG化对维持纳米粒胶体稳定性的作用

未经PEG修饰的BR NPs在PBS中孵育30分钟即发生明显聚集，而PEG NPs和ABR NPs在相同条件下均保持稳定的粒径分布，说明PEG化对维持纳米粒在生理盐溶液中的胶体稳定性至关重要。进一步将ABR NPs分别置于PBS、含10% FBS的PBS、含50%小鼠血清的PBS中，37℃孵育12小时，粒径和PDI均未出现显著波动，提示该平台具备在更接近体内环境的条件下维持结构完整性的能力。

Figure 3. PEG化使ABR NPs在多种生理介质中保持稳定

03Angiopep-2修饰对细胞摄取效率的影响

研究人员首先在PC12（神经元样细胞）、BV2（小胶质细胞）和bEnd.3（脑血管内皮细胞）三种细胞上测定了ABR NPs的安全浓度窗口，确定10 μM为后续实验的统一给药浓度。在该浓度下，通过共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞术（FCM）观察发现，无论是2小时还是4小时孵育，ABR NPs组在PC12和bEnd.3细胞中的荧光摄取信号均明显强于未经靶向修饰的PEG NPs组，提示Angiopep-2修饰确实提升了纳米粒被这两类细胞摄取的效率。进一步的机制研究显示，4℃条件下细胞对纳米粒的摄取明显减少，说明这一摄取过程依赖能量供给，符合受体介导内吞的特征。而对这一受体身份的最终确认借助了abinScience提供的LRP1抑制剂。

Figure 4. ABR纳米颗粒的细胞摄取

04体外模型与活体影像的双重验证

研究者搭建了基于bEnd.3细胞单层的体外血脑屏障模型，将PC12细胞置于下层模拟脑实质组织。结果显示，在12和24小时两个时间点，ABR NPs组转运至下层并被PC12细胞摄取的荧光强度，均显著高于游离FITC组和PEG NPs组。在更贴近真实病理状态的大脑中动脉阻塞（MCAO）小鼠模型中，研究者通过IVIS活体成像系统连续监测3、6、9、12、24小时的脑部荧光分布，发现ABR NPs组的脑部信号始终显著高于PEG NPs组，而游离Cy7很快被清除出体内循环。离体脑切片成像进一步显示，ABR NPs主要蓄积在缺血侧脑组织，对侧几乎无信号，蓄积强度也明显高于PEG NPs组；脑组织冷冻切片的共聚焦成像同样印证了这一靶向蓄积效果。这一系列结果共同说明，Angiopep-2修饰使纳米粒具备了主动穿越血脑屏障、定位缺血灶的能力，而非仅依靠PEG化带来的被动滞留。

Figure 5. ABR纳米颗粒的BBB跨膜能力

05化学体系与细胞层面的抗氧化验证

在无细胞化学体系中，ABR NPs对DPPH自由基、ABTS自由基、过氧化氢以及羟自由基均表现出剂量依赖性清除效果。在细胞层面，研究者通过氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型模拟缺血再灌注过程，并用DCFH-DA荧光探针检测PC12细胞内ROS水平。流式细胞术结果显示，OGD/R处理后细胞内ROS荧光强度升至对照组的18.69倍，验证了模型构建成功；而经ABR NPs处理后，这一数值降至2.59倍，效果优于PEG NPs（4.18倍）和未经靶向修饰的BR NPs（6.76倍），共聚焦显微镜观察结果与流式数据相互印证。这表明ABR NPs不仅在化学层面具有抗氧化活性，在细胞内也能高效清除因缺血再灌注而过量产生的ROS。此外，生物安全性评价显示，ABR NPs溶血率远低于5%安全阈值，30天体内毒性实验中小鼠血常规、肝肾功能及主要脏器组织学均未见异常，提示该纳米平台具有良好的生物安全性。

Figure 6. ABR纳米颗粒的ROS清除活性

06MCAO模型疗效验证

在细胞水平，OGD/R诱导的PC12细胞晚期凋亡率在ABR NPs处理后从对照组的21.2%显著降至13.1%。更重要的是，在MCAO小鼠模型中，ABR NPs表现出最强的神经保护作用。再灌注后静脉给药24小时，TTC染色显示生理盐水组脑梗死体积为37.88%，而ABR NPs组大幅降低至7.84%，显著优于PEG NPs（16.87%）、BR NPs（27.14%）及其他对照组。Zea-Longa神经功能评分也显示ABR NPs组小鼠神经功能损伤明显改善。组织病理学进一步证实：H&E染色显示ABR NPs组神经元结构基本正常；Nissl染色显示神经元排列和形态紊乱显著减轻；TUNEL染色显示凋亡细胞数量大幅减少；NeuN染色显示存活神经元密度高于其他治疗组。

Figure 7. ABR纳米颗粒对CIRI的治疗效果

07ROS清除与小胶质细胞M1/M2极化调控的双通路机制

在抗炎机制上，研究者建立LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症模型，证实含RAP的制剂可通过抑制mTOR磷酸化发挥抗炎作用。经ABR NPs处理后，小胶质细胞促炎标志物（CD86、TNF-α、IL-6）下降，抗炎标志物（CD206、IL-10、TGF-β）上升；体内实验结果一致，证实ABR NPs可促使小胶质细胞由促炎M1型向抗炎M2型转化。综合来看，ABR NPs通过"黄芩素清除ROS+雷帕霉素调控小胶质细胞极化"的双通路机制，结合Angiopep-2介导的血脑屏障穿越能力，实现了对缺血再灌注损伤的协同神经保护。

Figure 8. ABR纳米颗粒抑制M1型小胶质细胞极化并调控抗炎微环境