树突状细胞解决方案 Dendritic cell Panel

树突状细胞（Dendritic Cell，DC）是免疫系统中专职的抗原呈递细胞（APC），起源于骨髓中的造血干细胞（HSCs）。DC以其高效的抗原摄取、加工和呈递能力，在连接先天免疫与适应性免疫中扮演核心角色。未成熟DC具有强大的迁移能力，通过吞噬病原体或凋亡细胞碎片感知危险信号；成熟DC则通过MHC分子和共刺激分子（如CD80/CD86）激活初始T细胞（Naïve T cells），启动适应性免疫反应。此外，DC通过分泌细胞因子（如IL-12、IFN-α）和调控T细胞耐受性，广泛参与免疫稳态和病理过程。DC分布于外周组织（如皮肤、肠道）和淋巴器官，充当“免疫哨兵”。

DC主要分为经典型树突状细胞（cDC）和浆细胞样树突状细胞（pDC），均来源于共同DC前体（CDP）。cDC在外周组织分化成熟，pDC则在骨髓中发育并以分泌I型干扰素（如IFN-α）抗病毒为主要功能。在炎症条件下，单核细胞可分化为单核样树突状细胞（moDC），增强局部免疫反应。DC的多样性体现在其亚群的功能特化，如交叉抗原呈递（Cross-presentation）由cDC1主导，而pDC则在病毒感染中迅速应答。

Fig 1. Dendritic cells and immunoregulation

人DC包括多种功能性亚群：moDC参与炎症反应，pDC通过IFN-α抗病毒，cDC1（CD141⁺/XCR1⁺）专于交叉呈递激活CD8⁺ T细胞，cDC2（CD1c⁺）驱动CD4⁺ T细胞应答，朗格汉斯细胞（LC）在表皮中负责局部免疫监视。小鼠DC与之类似，但标志物和分布有所差异。

小鼠DC包括moDC、pDC、cDC1（CD8α⁺/XCR1⁺）、cDC2（CD11b⁺）和LC。cDC1以交叉呈递激活CD8⁺ T细胞为主，cDC2驱动Th2/Th17应答，pDC分泌IFN-α抗病毒，LC在皮肤中维持局部免疫平衡。小鼠与人类DC在功能上趋同，但在标志物（如CD8α、SiglecH）和组织分布上存在差异。

树突状细胞流式检测完整流程

流式细胞术是解析DC亚群及其功能状态的核心技术。以下为优化后的完整操作流程，确保高灵敏度和特异性。

• 1. 样本准备
  • 样本收集：从外周血（EDTA抗凝管）分离PBMC（Ficoll密度梯度离心），或从组织（脾脏、淋巴结、皮肤）制备单细胞悬液（机械研磨或酶消化，如胶原酶IV+DNase I，37°C处理30分钟）。
  • 红细胞裂解：外周血样本用1×红细胞裂解液（蒸馏水稀释）处理5-10分钟，400g离心5分钟，弃上清。
  • 洗涤：用PBS + 2% FBS洗涤2次，400g离心5分钟。
  • 计数与调整：用血细胞计数仪调整浓度至1-2×10⁶ cells/mL（100 µL/管）。
  • Fc阻断：加入Fc受体阻断剂（如Human Fc Block或Mouse CD16/CD32抗体），4°C孵育10分钟，减少非特异性结合。
• 2. 抗体标记
  • 抗体选择：人DC用HLA-DR、CD11c（排除单核细胞）、CD1c、CD141、CD303、CD207；小鼠用MHC-II、CD11c、CD8α、XCR1、PDCA-1。成熟标志物（如CD80、CD86）评估活化状态。
  • 孵育：每10⁶细胞加入1-5 µL抗体（100 µL体积），4°C避光孵育30分钟。
  • 洗涤：加1-2 mL流式缓冲液（PBS + 2% FBS），400g离心5分钟，弃上清，重复2次。
• 3. 染色与固定（可选）
  • 死细胞排除：加入7-AAD或PI（按说明书浓度），室温孵育5分钟，筛选活细胞。
  • 胞内染色：检测IL-12、IFN-α等细胞因子时：
    • 固定：4%多聚甲醛，10分钟，400g离心。
    • 通透：0.1% Triton X-100，5分钟。
    • 标记：加入胞内抗体，4°C孵育30分钟，洗涤2次。
• 4. 数据采集
  • 仪器设置：匹配荧光团与激光器（如FITC用488 nm，APC用633 nm），调整PMT电压。
  • 对照：设置未染色、单染和同型对照，用于补偿和特异性验证。
  • 上机：转移至流式管，采集50,000-100,000个事件，流速控制在200-500 events/s。
  • 门控：FSC/SSC圈定单核细胞，HLA-DR⁺/MHC-II⁺筛选DC，再细分亚群。
• 5. 数据分析与特定亚群分析
  • 软件：用FlowJo或Cytobank导入FCS文件。
  • 门控策略：
    • 单核细胞门：FSC/SSC散点图圈定单核细胞群，排除碎片。
    • 活细胞门：用7-AAD⁻排除死细胞。
    • DC总门：人用HLA-DR⁺CD11c⁺（排除CD14⁺单核细胞），小鼠用MHC-II⁺CD11c⁺。
    • 特定亚群分析：
      • 人pDC：在HLA-DR⁺CD11c⁻门中，筛选CD303⁺CD123^High细胞，评估IFN-α分泌能力。
      • 人cDC1：在HLA-DR⁺CD11c⁺门中，筛选CD141⁺XCR1⁺细胞，检测交叉呈递相关标志物（如CLEC9A）。
      • 人cDC2：在HLA-DR⁺CD11c⁺门中，筛选CD1c⁺CD11b⁺细胞，评估CD4⁺ T细胞激活能力。
      • 人LC：在表皮样本中，筛选HLA-DR⁺CD207⁺CD1a⁺细胞。
      • 小鼠pDC：在MHC-II⁺CD11c^Low门中，筛选PDCA-1⁺SiglecH⁺细胞。
      • 小鼠cDC1：在MHC-II⁺CD11c⁺门中，筛选CD8α⁺XCR1⁺细胞。
      • 小鼠cDC2：在MHC-II⁺CD11c⁺门中，筛选CD11b⁺CD172⁺细胞。
  • 荧光补偿：基于单染对照调整荧光溢出。
  • 结果解读：
    • pDC比例升高：提示病毒感染或I型干扰素应答增强。
    • cDC1增加：可能与抗肿瘤免疫或CD8⁺ T细胞激活相关。
    • cDC2主导：常见于Th2/Th17驱动的炎症环境。
    • CD80/CD86高表达：指示DC成熟，提示免疫激活状态。
  • 输出：生成散点图（如CD11c vs. HLA-DR、CD141 vs. XCR1）、直方图，计算亚群比例和MFI。

注意事项

• 全程避光操作，避免荧光猝灭。
• 样本制备后2小时内上机，防止细胞凋亡。
• 用40-70 µm滤网去除团聚细胞。
• 定期校准仪器，确保数据一致性。

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