免疫实验全拆解｜第2期：IHC 染出来的图，真的可信吗？

引言

在进行免疫组化（IHC）实验时，很多科研人员都会遇到一个问题：信号不清晰或背景染色过深。这时候，你的图像究竟能不能代表真实的结果？是否可靠？今天我们就从IHC实验的关键点入手，解读那些常见的误区与优化方法，让你的实验结果更加可信。

什么是IHC实验？

免疫组化（IHC，Immunohistochemistry）是一种基于抗体特异性结合的技术，用于检测固定组织切片中特定蛋白质的分布和表达水平。其原理是通过特异性一抗结合目标蛋白，再通过标记有酶（如HRP）或荧光染料的二抗放大信号，最终通过显色反应（如DAB显色）或荧光显微镜检测蛋白定位。IHC广泛应用于医学诊断（如癌症标志物检测）和科研（如组织蛋白表达分析），因其能直观显示蛋白在组织中的空间分布而备受青睐。

IHC与其他技术的区别

免疫组化（IHC）常与免疫细胞化学（ICC）、免疫荧光（IF）及冻存免疫荧光（IF-FR）混淆，以下表格对比了它们的主要区别：

IHC实验：是时候拆解一下了！

免疫组化实验是一种用于检测组织中蛋白质分布和表达水平的强大工具，广泛应用于癌症标志物、免疫反应等领域。尽管IHC是一项常规技术，但很多初学者和经验较少的科研人员，常常会遇到背景过高、信号模糊等问题。这些问题不仅影响实验结果的准确性，也使得数据解释变得困难。

常见问题与优化建议

1. 信号不清楚、背景过高

这种问题通常出现在以下几种情况：

• 封闭剂选用不当：如使用了奶粉封闭液，可能会导致非特异性结合，增加背景。
• 抗体浓度过高：过多的抗体可能导致非特异性结合和高背景。
• 过度暴露：曝光时间太长会加剧背景染色。

解决方法：

• 使用 BSA 或牛血清白蛋白（BSA）作为封闭液，减少非特异性结合。
• 通过梯度稀释优化抗体浓度，避免使用过高的浓度，通常1:100–1:500的浓度范围适用于大多数IHC实验。
• 适当调整曝光时间，并使用长曝光查看信号变化，避免过度曝光。

2. 背景染色偏深或信号弱

这类问题通常来源于抗体与组织之间的非特异性结合，或者是膜转移过程中出现问题。

解决方法：

• 对于组织样本，适当使用抗原修复技术增强抗体结合。
• 确保膜转移过程中的细节，避免气泡和膜损伤。
• 调整洗涤步骤，避免因洗涤不足造成的非特异性结合。

3. 过度修复与处理

在某些情况下，抗原修复的过度处理会导致组织结构被破坏，从而影响抗体的识别。

解决方法：

• 抗原修复是一个至关重要的步骤，但不宜过度。使用 Tris-EDTA 缓冲液可有效修复大部分蛋白质，但要注意避免过度处理。
• 根据抗体的性质和抗原类型，选择合适的修复方法，避免对组织样本造成过多损害。

小贴士：正确的抗体浓度和修复方案

对于免疫组化实验，除了正确的抗体选择与浓度外，抗原修复也是成功的关键。以下是一些常见的修复方法：

抗体浓度推荐：

• 鼠源一抗：1:100–1:500，二抗为1:500–1:1000。
• 兔源一抗：1:200–1:500，二抗为1:500–1:1000。

实验操作示意图

图例建议：

• IHC背景优化前后对比图（ 免疫组织化学（a、b）和免疫荧光（c）染色在优化背景前（左：仅抗体）与优化后（右：抗体 + GSH处理）的对比图。箭头所示区域为未处理样本中的高背景信号，GSH处理后非特异性染色显著降低，信号更集中，组织结构更清晰。）

Fig.1.IHC背景优化前后对比图

• 不同修复方案对组织染色的影响（ 免疫组织化学（a、b）和免疫荧光（c）染色在优化背景前（左：仅抗体）与优化后（右：抗体 + GSH处理）的对比图。箭头所示区域为未处理样本中的高背景信号，GSH处理后非特异性染色显著降低，信号更集中，组织结构更清晰。）

Fig.2.不同修复方案对组织染色的影响

总结：细节决定成败

免疫组化实验成功与否往往取决于细节的把控。从样本处理到抗体选择，再到修复和洗涤，每一步都可能影响最终结果。只要你在每个步骤上精益求精，就能够得到清晰、准确的实验图像。

下一期预告

《免疫实验全拆解｜第3期：ELISA，你的实验结果稳定吗？》

从实验设计到分析结果，ELISA常见问题都在这里！敬请期待。