免疫实验全拆解｜第4期：流式细胞术，你的数据真的“准”吗？

引言

流式细胞术（FCM）是现代免疫学研究中不可或缺的实验工具，它被广泛用于细胞分析、表面标记物的检测、细胞周期分析等。然而，尽管流式细胞术的技术本身非常强大，如何准确地获得可靠数据，仍然是一项需要精细操作的挑战。通过优化实验设计和数据分析，可以显著提升检测精度和质量控制。

如果你也曾在流式实验中遇到过信号不清晰、背景噪音干扰、阳性率过低等问题，或者数据与预期结果严重不符，那你可能需要重新审视你的实验流程。针对这些问题，我们将提供评估和改进的解决方案，确保实验结果的可靠性。

这篇文章我们将重点分析流式细胞术实验中的常见问题，并给出针对性的优化建议，帮助你提高实验的稳定性和数据质量。

什么是流式细胞术？

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种利用激光和荧光检测技术分析单个细胞特性的高级工具。其原理是通过将细胞悬液高速通过激光束，测量细胞的大小（前向散射，FSC）、颗粒度（侧向散射，SSC）及荧光标记物的表达（如抗体结合的荧光染料）。这些信号被光电探测器捕获并转化为数据，用于定量分析细胞表面或内部标记物。FCM广泛应用于免疫学研究（如免疫细胞亚群分析）、细胞周期检测和疾病诊断，因其高通量、多参数分析和量化能力而备受推崇。

荧光素补偿波长对比

在流式细胞术中，荧光重叠是常见问题，需通过补偿调整波长以减少干扰。以下是市场常见荧光素按激光类别组织的补偿波长对比，包括紫外、紫色、蓝色、黄色绿色和红色激光激发范围内的染料：

注：相对分辨率根据在多种特异性和仪器上测量的平均染色指数确定，1 = 暗淡 (Dim)，2 = 中度 (Moderate)，3 = 明亮 (Bright)，4 = 非常明亮 (Very Bright)。值可能因仪器平台和配置（如激光、功率、滤光片）而变化。

流式细胞术实验的常见问题

无信号，无法检测

可能原因：

• 细胞样本处理不当：导致抗体或标记物无法有效结合，影响检测和识别。
• 抗体选择不当：或者标记物与细胞的结合力较弱。
• 检测仪器设置问题：如激光功率过低、光谱设置不准确。

解决方法：

• 重新优化样本的处理步骤，确保细胞完整性及表面标记物暴露，提升检测效率。
• 选用适合目标的高亲和力抗体以增强结合。
• 调整流式细胞仪的激光功率、光谱及过滤器设置，验证仪器性能。

背景信号过强，干扰分析

可能原因：

• 非特异性结合：抗体过量或使用了不合适的封闭剂，影响质量控制。
• 背景噪音过高：导致真正的信号被淹没，干扰监测。

解决方法：

• 使用适量的抗体，进行预实验确定最佳浓度以优化分析。
• 选择背景低的封闭剂（如 BSA），确保背景清晰，信号突出并进行质量监控。

阳性细胞比例过低

可能原因：

• 细胞活性差：抗体结合不完全，影响量化。
• 样本中阳性细胞比例本身较低：或者细胞群体分散。

解决方法：

• 优化细胞的培养和处理方法，确保细胞活性与膜表面抗原的完整性，增强检测结果。
• 增加抗体反应的时间或浓度，确保与目标细胞的结合充分，提高阳性比例。

流式细胞术实验步骤与优化

细胞准备

处理好细胞，避免细胞团聚，确保单细胞悬浮液，这一过程是实验技术的基础。

使用PBS清洗细胞，去除多余的培养基或其他干扰物，优化样本质量。

抗体孵育

选择合适的抗体亚型、标记和浓度，避免过多或过少的抗体加入，精炼实验条件。

一般建议使用小分子或者高亲和力的标记抗体，提高靶标的特异性和分析精度。

信号检测与分析

设置合适的检测门限，确保目标信号与背景的分离，调整监测参数。

在分析时，可以根据样本的性质和特征，调整相关参数，如粒度、前向/侧向散射等，优化数据处理。

实验对比图

图例建议：

• 流式细胞术实验中使用与未使用对照组的信号差异图（用于评估和比较）

Fig.1.没有对照组时容易高估阳性细胞比例 vs 使用对照组后明确阳性门限

• 背景噪音与清晰信号对比图（用于评价信号质量）

总结

流式细胞术实验的成功依赖于每一个细节的精准控制。无论是抗体的选择、浓度的优化，还是仪器设置，都可能影响最终的实验结果。通过精准的操作、合理的优化和质量保证，我们可以避免常见问题，获取稳定、可靠的数据并改进实验过程。

下一期预告

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