1. 内源性凋亡通路在“指标库”里的定位
在前面已经写过的 DNA 损伤应答（DNA Damage Response）和应激丝裂原活化蛋白激酶（Stress Mitogen-Activated Protein Kinase）等篇章基础上， 内源性凋亡通路（intrinsic / mitochondrial apoptosis）是“细胞命运”模块里必须单独拎出来的一条主轴： 多种应激（DNA 损伤、内质网应激、生长因子撤除、细胞毒药物等）可通过 B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，BCL-2）家族调控线粒体外膜通透性（mitochondrial outer membrane permeabilization），释放细胞色素 c（Cytochrome c）， 组装凋亡体（apoptosome：Apaf-1 + Caspase-9），继而激活“执行者” Caspase-3/7，完成程序性死亡。 [1–3]
本篇只关心：内源性凋亡要测哪些指标？各自代表什么？在什么实验平台上最好用？
快速印象： 可以把内源性凋亡的 readout 拆成三段： 上游 BCL-2 家族平衡（BAX/BAK vs BCL-2/BCL-xL/MCL-1） → 线粒体外膜通透性与 Cyt c 释放 → Caspase-9/3 激活 + 多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly(ADP-ribose) polymerase，PARP）裂解 + Annexin V/PI readout。
图1. 细胞凋亡的形态学要点示意（Wikimedia Commons，用于直观说明“细胞皱缩/膜泡/凋亡小体”等概念）。 （图源见参考文献 [14]）
2. 一眼看懂：BCL-2–线粒体外膜通透性–Caspase-9–Caspase-3 轴核心 readout 列表
| 指标 |
常用位点 / 读出 |
代表意义 |
推荐样本 / 方法 |
使用提示 |
| BCL-2 家族表达谱 |
BAX、BAK、BCL-2、BCL-xL、MCL-1、BIM、PUMA、NOXA 等总蛋白 |
决定细胞对内源性凋亡的敏感性，是“阈值设置器” |
蛋白质免疫印迹（Western blot） |
用于解释不同细胞系或处理条件下“同样刺激，有的容易死，有的很顽强”的差异 [1–2] |
| BH3-only 蛋白诱导 |
BIM、PUMA、NOXA、BAD 等的上调或去磷酸化 |
连接上游应激（例如 p53、内质网应激）与 BAX/BAK 激活 |
实时定量聚合酶链式反应（qPCR）；Western blot |
在 DNA 损伤和 p53 相关模型中，PUMA/NOXA 上升常见 [2] |
| BAX/BAK 激活与寡聚化 |
构象特异性 BAX/BAK 抗体；BAX/BAK 寡聚体 |
标志线粒体外膜通透性即将或正在发生 |
免疫沉淀 + Western blot；构象特异性免疫荧光 |
偏机制研究；建议与线粒体膜电位 / Cyt c 释放联用 [2–3] |
| 线粒体膜电位丧失 |
四乙基罗丹明乙酯（Tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE）/TMRM 荧光降低；或 JC-1 红/绿比值下降 |
线粒体功能崩溃的功能 readout |
流式细胞术；荧光显微 |
推荐与 Annexin V/PI 联用分层：健康/早期凋亡/晚期死亡 [10] |
| Cytochrome c 释放 |
胞浆分级中 Cyt c 蛋白；或免疫荧光中由点状转为弥散 |
线粒体外膜通透性发生后的关键事件，是凋亡体形成前提 |
细胞分级 + Western blot；免疫荧光 |
分级纯度很关键；建议加线粒体标记与胞浆对照 [3] |
| Apaf-1 与凋亡体组装 |
Apaf-1 总蛋白；高分子复合物中的 Apaf-1 / Caspase-9 |
凋亡体的结构与功能核心 |
Western blot；免疫沉淀；蓝色原位凝胶 |
更偏机制研究；用于证明“确实走了线粒体凋亡体” [4] |
| Caspase-9 激活 |
Caspase-9 裂解条带；或活性底物法 |
内源性凋亡“起始 caspase”激活 |
Western blot；比色 / 荧光底物法 |
与 Cyt c 释放 + Caspase-3 裂解联用，证据链更完整 [4] |
| Caspase-3/7 激活 |
Cleaved Caspase-3（p17/p19）；或活性探针 |
执行者 caspase，直接切割多种底物 |
Western blot；流式活性探针；底物法 |
作为“通用终点指标”非常稳；建议与 PARP 放在同一张膜上 [6] |
| PARP 裂解 |
Cleaved PARP（经典约 85–89 kDa 片段） |
执行期凋亡的经典分子 readout |
Western blot |
与 Cleaved Caspase-3 同步出现时，论证力度显著增强 [6] |
| Annexin V/PI 凋亡分型 |
Annexin V 阳性、PI 阴/阳细胞比例 |
外翻磷脂酰丝氨酸与膜完整性丧失的经典 readout |
流式细胞术；荧光显微 |
区分早期凋亡（Annexin V+ PI−）与晚期/继发坏死（Annexin V+ PI+） [8] |
| TUNEL / DNA 片段化 |
TUNEL 阳性细胞；Sub-G1 峰 |
DNA 有序裂解，凋亡偏晚期 readout |
TUNEL 染色；流式细胞周期 |
适合组织切片/体内模型，作为“终态确认”很有说服力 [9] |
3. 组合搭配思路：按上游刺激与药物机制选 intrinsic apoptosis panel
内源性凋亡的刺激来源多样（DNA 损伤、内质网应激、缺氧、线粒体毒性等），panel 设计建议从 “上游—线粒体—执行者”三段去组合，避免只做 Annexin V 或 Cleaved Caspase-3 而讲不清机制。
3.1 Panel A：DNA 损伤 → p53 依赖的内源性凋亡
- 推荐组合：p53 + PUMA/NOXA + BAX + Cyt c 释放 + Caspase-9 + Cleaved Caspase-3 + PARP
- 适用问题：放疗或 DNA 损伤化疗药物是否通过 p53–BH3-only–BAX 轴驱动内源性凋亡？
- 读图习惯：早期 p53 与 PUMA/NOXA 上升，随后 Cyt c 释放 + Caspase-9 激活，再往后 Cleaved Caspase-3/PARP 与 Annexin V 阳性细胞增加。
3.2 Panel B：线粒体毒性 / 代谢抑制剂
- 推荐组合：线粒体膜电位（TMRE/TMRM 或 JC-1）+ Cyt c 释放 + Caspase-9/3 + Annexin V/PI
- 适用问题：候选药物是否直接针对线粒体，引发线粒体外膜通透性与内源性凋亡？
- 读图习惯：膜电位下降通常更早出现，随后 Cyt c 释放与 caspase 裂解增强 [10]
3.3 Panel C：BCL-2 抑制剂 / BH3 mimetics（例如 Venetoclax）
- 推荐组合：BCL-2/BCL-xL/MCL-1 水平 + BAX/BAK + 膜电位 + Caspase-3/7 + Annexin V
- 适用问题：BH3 mimetic 是否通过解除 BCL-2 家族抑制，引发 BAX/BAK 依赖的内源性凋亡？
- 读图习惯：在 BCL-2 高表达细胞里，“膜电位下降 + caspase 裂解 + Annexin V 分型”通常能形成很干净的证据链。
3.4 Panel D：区分内源性 vs 外源性凋亡
- 推荐组合：Caspase-8（外源性）+ Caspase-9（内源性）+ Bid（tBid）+ Caspase-3/7 + Annexin V
- 适用问题：死亡信号主要来自死亡受体还是线粒体轴？两者是否存在交叉放大？
- 读图习惯：内源性通路通常表现为 Caspase-9 更突出；外源性通路早期 Caspase-8 更强；Bid 裂解可作为交叉桥梁。
4. 不同实验平台怎么选内源性凋亡指标？
实操建议： 平台选择并不等于“能测什么就测什么”，而是优先满足评审最关心的三件事： （1）是否真是凋亡；（2）是否走线粒体轴；（3）是否能解释上游机制。
| 指标类型 |
Western blot
（蛋白/裂解） |
流式细胞术
（单细胞分型） |
免疫荧光
（定位/形态） |
功能实验
（长期结局） |
上游阈值
BCL-2 家族表达、BH3-only 诱导 |
✓ |
|
|
|
线粒体轴
膜电位、Cyt c 释放 |
✓ |
✓ |
✓ |
|
执行期
Caspase-9/3、PARP 裂解 |
✓ |
✓ |
✓ |
|
分型输出
Annexin V/PI、TUNEL、Sub-G1 |
|
✓ |
✓ |
|
长期生存/致死
克隆形成、细胞活力、实时细胞分析 |
|
|
|
✓ |
注：最省指标的“实用组合”通常是：膜电位（TMRE/TMRM 或 JC-1） + Cleaved Caspase-3 / Cleaved PARP（分子证据） + Annexin V/PI（单细胞分型）； 若需要证明“线粒体轴”，再加 Cyt c 释放或 Caspase-9。
5. 小结：内源性凋亡通路的「必备四件套」
如果只想用最少的指标覆盖内源性凋亡，建议优先考虑：
- 线粒体膜电位（TMRE/TMRM 或 JC-1）：作为线粒体外膜通透性前后的功能 readout [10]
- Cytochrome c 释放：作为线粒体 → 胞浆信号传递关键证据 [3–4]
- Cleaved Caspase-3 + Cleaved PARP：作为执行期凋亡的分子 readout [6]
- Annexin V/PI 或 TUNEL：作为单细胞或组织层面的终态 readout [8–9]
加上本篇，你的“细胞命运”模块可以很自然地串起来：DNA 损伤应答 → 应激通路 → 内源性凋亡。 在专题页里画出一条“损伤—应激—凋亡”的指标路线图，再挂载抗体/试剂盒/检测试剂列表，会非常顺手。
参考文献
- Youle RJ, Strasser A. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2008;9:47–59. doi:10.1038/nrm2308.
- Chipuk JE, Moldoveanu T, Llambi F, Parsons MJ, Green DR. The BCL-2 family reunion. Molecular Cell. 2010;37(3):299–310. doi:10.1016/j.molcel.2010.01.025.
- Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiological Reviews. 2007;87(1):99–163. doi:10.1152/physrev.00013.2006.
- Zou H, Henzel WJ, Liu X, Lutschg A, Wang X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 1997;90(3):405–413. doi:10.1016/S0092-8674(00)80501-2.
- Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 1997;91(4):479–489.
- Tewari M, Quan LT, O'Rourke K, et al. Yama/CPP32β, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 1995;81(5):801–809. doi:10.1016/0092-8674(95)90541-3.
- Vermes I, Haanen C, Steffens-Nakken H, Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis: flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 1995;184(1):39–51. doi:10.1016/0022-1759(95)00072-I.
- Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. Journal of Cell Biology. 1992;119(3):493–501. doi:10.1083/jcb.119.3.493.
- Scaduto RC Jr, Grotyohann LW. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 1999;76(1 Pt 1):469–477. doi:10.1016/S0006-3495(99)77214-0.
- Souers AJ, Leverson JD, Boghaert ER, et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nature Medicine. 2013;19:202–208. doi:10.1038/nm.3048.
- Wang C, Youle RJ. The role of mitochondria in apoptosis. Annual Review of Genetics. 2009;43:95–118. doi:10.1146/annurev-genet-102108-134850.
