流式研习社丨光谱流式与常规流式：补偿与光谱拆分的比较分析

近年来，光谱流式细胞术（Spectral Flow Cytometry）逐渐成为流式细胞领域最受关注的新技术之一。从仪器厂商的宣传资料，到学术会议和技术培训课程，"40色以上检测能力""无需补偿""解决串色问题"等表述频繁出现。其中，"无需补偿"几乎已经成为光谱流式最具代表性的标签之一。然而，这种说法也引发了许多误解。一些研究人员认为，光谱流式已经彻底摆脱了荧光信号重叠的问题；还有观点认为，常规流式依赖补偿，而光谱流式则不再需要任何信号校正过程。事实并非如此。荧光光谱重叠是所有荧光检测技术都无法回避的客观物理现象。光谱流式并没有消除光谱重叠，而是采用了与传统补偿不同的方式处理重叠信号。理解这一点，才能真正认识光谱流式与常规流式之间的区别。

一、常规流式与光谱流式：检测方式有什么不同？

要理解补偿与拆分之间的关系，首先需要了解两种技术如何采集荧光信号。

常规流式：检测几个特定波段

在常规流式细胞术中，荧光素被激发后会产生覆盖一定波长范围的发射光谱。以FITC为例，其发射光谱并非集中于某一个波长，而是在约500–600 nm范围内形成一个连续分布的发射曲线。然而，常规流式并不会记录整个发射光谱。仪器通过滤光片从完整光谱中截取一个特定波段，例如530/30 nm检测通道主要收集515–545 nm范围内的光信号，然后由光电倍增管（PMT）进行检测。因此，对于每一种荧光素而言，常规流式实际利用的是完整光谱中的一小部分信息。

光谱流式：记录完整发射光谱

光谱流式采用了不同的数据采集策略。它不再依赖单个滤光片对应单个检测通道的模式，而是将发射光谱连续分布到多个检测器上，同时记录荧光素在整个发射波段中的信号分布情况。换句话说，常规流式获得的是几个离散检测点的信息，而光谱流式获得的是一条更完整的光谱曲线。

图1. 常规流式与光谱流式检测原理对比

二、为什么所有流式技术都会出现串色？

无论采用常规流式还是光谱流式，荧光素的发射光谱都不是单一波长，而是具有一定宽度的连续分布。因此，不同荧光素之间不可避免会发生光谱重叠。例如FITC的发射光谱除了覆盖自身主要检测区域外，还会延伸进入PE相关检测区域；PE的发射光谱同样可能进入其他邻近通道。这种由于发射光谱重叠而导致的信号进入非目标检测区域的现象，被称为光谱溢出（Spillover）。

图2. 不同荧光素光谱重叠

光谱重叠是荧光分子本身的物理属性决定的，并不会因为检测技术的改变而消失。因此，只要使用荧光染料，就一定存在信号校正的问题。区别仅在于校正方法不同。

三、常规流式如何处理光谱重叠？

常规流式采用补偿（Compensation）的方法处理信号溢出。补偿的核心思想并不复杂。通过单染对照测定某种荧光素进入其他检测通道的比例，然后建立补偿矩阵，将这些额外贡献的信号从对应通道中扣除。例如：

假设FITC有20%的信号进入PE检测通道。当PE通道检测到1000单位信号时，系统会根据补偿矩阵计算其中来自FITC的贡献，并将这部分信号扣除，剩余部分作为真实PE信号。因此，补偿本质上是一种数学校正过程，其目标是从混合信号中恢复各荧光素的真实贡献。

图3. 补偿原理

四、光谱流式如何处理光谱重叠？

光谱流式采用的是光谱拆分（Unmixing）。与传统补偿相比，拆分的目标完全一致，都是从混合荧光信号中识别并分离不同荧光素的贡献。两者最大的区别在于使用的信息量不同。传统补偿主要利用几个检测通道之间的信号关系进行计算。而光谱拆分利用的是整个发射光谱的信息。系统首先通过单染对照建立每种荧光素的参考光谱库，然后将实验样本获得的混合光谱与参考光谱进行匹配计算，最终确定每种荧光素在总光谱中的贡献比例。因此，光谱拆分并不是绕过了信号校正，而是在更丰富的数据基础上完成信号校正。

图4. 光谱拆分原理

五、补偿与拆分究竟是什么关系？

在实际讨论中，补偿与拆分经常被描述为两种完全不同的技术。但从数学本质来看，两者都属于混合信号的反卷积过程。两者的共同目标都是：从检测到的总信号中，还原每一种荧光素真实的信号贡献。

区别在于：

• •    传统补偿利用少量检测通道的数据
• •    光谱拆分利用完整发射光谱的数据

因此，光谱拆分并不是对补偿原理的否定，而是在相同目标下采用了不同的数据来源和计算方式。从这个角度来看，光谱拆分更像是传统补偿思想的延伸，而不是完全替代。

六、光谱拆分一定优于传统补偿吗？

答案并非绝对。当两个荧光素的发射光谱高度重叠，但整体光谱形状仍然存在明显差异时，光谱拆分通常能够获得更好的分离效果。例如：PerCP-Cy5.5/PE-Cy5.5，虽然二者的发射峰位置十分接近，但整体光谱曲线仍然存在差异，光谱流式能够利用这些差异完成信号识别。

图5. PerCP-Cy5.5/PE-Cy5.5光谱及光谱拆分与补偿结果对比

然而，对于某些光谱高度相似甚至呈包含关系的荧光素组合，情况则不同。例如：

• •    APC与AF647
• •    PE-CF594与PE-Dazzle 594

在这些组合中，两种荧光素的大部分特征信息甚至光谱信息高度重合，可供区分的有效光谱特征十分有限。

图6. APC与AF647，PE-CF594与PE-Dazzle 594光谱拆分与补偿结果对比

因此，光谱拆分并不能完全消除由荧光素本身相似性带来的误差，其性能优势也存在明确边界。

七、"无需补偿"真正意味着什么？

经过上述分析可以发现，光谱流式并没有消除荧光重叠，也没有取消信号校正过程。所谓"无需补偿"，更准确的含义是：无需建立传统意义上的补偿矩阵。但系统仍然需要：

• •    制备单染对照
• •    建立参考光谱库
• •    执行光谱拆分计算
• •    校正荧光信号重叠

事实上，相比传统补偿，光谱流式对于参考光谱质量的依赖程度更高。荧光素批次差异、串联染料降解、固定处理条件变化等因素引起的微小光谱偏移，都可能影响拆分结果。因此，"无需补偿"并不等于"无需校正"，更不等于"没有串色"。

结语

光谱流式细胞术的发展为流式细胞术带来了新的信号解析方式，但它并没有改变荧光光谱重叠这一客观物理事实。传统补偿与光谱拆分并非相互对立的两种技术，而是在相同目标下采用不同数据来源的两种信号校正策略。理解这一点，有助于更客观地认识光谱流式的技术优势与应用边界，也能够避免将"无需补偿"简单理解为"无需信号校正"的常见误区。

关于我们

abinScience创立于法国，专注于高质量生命科学试剂的开发与生产，立足法国斯特拉斯堡创新科技中心，以"Empowering Bioscience Discovery"为愿景。

abinScience流式抗体产品覆盖常用检测指标，品类丰富，可满足多物种（ Human/ Mouse/ Rat/ Dog/ Hamster/ Monkey 等）科研实验需求，为科研提供稳定可靠的支持。

Reference:

• [1] Nolan, J. P., & Condello, D. (2013). Spectral flow cytometry. Current protocols in cytometry, Chapter 1, 1.27.1–1.27.13. https://doi.org/10.1002/0471142956.cy0127s63
• [2] Futamura, K., Sekino, M., Hata, A., Ikebuchi, R., Nakanishi, Y., Egawa, G., Kabashima, K., Watanabe, T., Furuki, M., & Tomura, M. (2015). Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology, 87(9), 830–842. https://doi.org/10.1002/cyto.a.22725
• [3] Niewold, P., Ashhurst, T. M., Smith, A. L., & King, N. J. C. (2020). Evaluating spectral cytometry for immune profiling in viral disease. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology, 97(11), 1165–1179. https://doi.org/10.1002/cyto.a.24211