自然杀伤性细胞解决方案 NK cell Panel

自然杀伤细胞（NK细胞）起源于骨髓中的造血干细胞（HSCs），通过多阶段分化形成功能成熟的亚群。各阶段伴随关键表面标志物的动态变化，可通过流式细胞术进行精准分型与发育追踪。NK细胞在先天免疫中发挥关键作用，能够快速杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞，同时通过分泌细胞因子（如IFN-γ）调节适应性免疫。

Fig 1. Mechanisms leading to impaired cytotoxicity in NK cells within the tumor microenvironment (DOI: 10.1016/j.lfs.2023.121997)

Fig 2. Surface markers defining immature and mature NK cells in mouse and human

CD56^bright 与 CD56^dim 亚群功能解析

人NK细胞根据CD56表达水平分为两大功能亚群，分布和功能差异显著：

• CD56^brightCD16⁻：主要分布于淋巴组织，表达高水平趋化因子受体（如CCR7），以分泌细胞因子（如IFN-γ、IL-10、TNF-α）为主，发挥免疫调节作用。
• CD56^dimCD16⁺：占外周血NK细胞的90%以上，表达杀伤性受体（如KIR、NKG2D），通过颗粒酶/穿孔素和ADCC（抗体依赖性细胞毒性）直接杀伤靶细胞。

人NK细胞分型与功能特征

小鼠与人类NK细胞对照分析

小鼠NK细胞与人类NK细胞功能相似，但标志物差异明显。小鼠常用CD11b和CD27分型，结合NK1.1和Ly49系列受体进行亚群鉴定。

NK细胞流式检测完整流程

流式细胞术是解析NK细胞亚群及功能状态的核心技术。以下为优化后的完整操作流程，确保高灵敏度和准确性。

• 1. 样本准备
  • 样本收集：从外周血（EDTA抗凝管）分离PBMCs（Ficoll密度梯度离心），或从小鼠脾脏/骨髓制备单细胞悬液（酶解或机械研磨）。
  • 红细胞裂解：用1×红细胞裂解液（蒸馏水稀释）处理5-10分钟，400g离心5分钟，弃上清。
  • 洗涤：用PBS + 2% FBS洗涤2次，400g离心5分钟。
  • 计数与调整：用血细胞计数仪调整浓度至1-2×10⁶ cells/mL（100 µL/管）。
  • Fc阻断：加入Fc受体阻断剂（如Human Fc Block或Mouse CD16/CD32抗体，货号：FMK22710），4°C孵育10分钟，减少非特异性结合。
• 2. 抗体标记
  • 抗体选择：人NK细胞常用CD3（排除T细胞）、CD56、CD16、NKG2D、KIR；小鼠用CD3、NK1.1、CD49b、CD11b、CD27。建议预先滴定抗体。
  • 孵育：每10⁶细胞加入1-5 µL抗体（100 µL体积），4°C避光孵育30分钟。
  • 洗涤：加1-2 mL流式缓冲液（PBS + 2% FBS），400g离心5分钟，弃上清，重复2次。
• 3. 染色与固定（可选）
  • 死细胞排除：加入7-AAD或PI（按说明书浓度），室温孵育5分钟，区分活细胞。
  • 胞内染色：检测IFN-γ或颗粒酶B时：
    • 固定：4%多聚甲醛，10分钟，400g离心。
    • 通透：0.1% Triton X-100，5分钟。
    • 标记：加入胞内抗体（如anti-IFN-γ），4°C孵育30分钟，洗涤2次。
• 4. 数据采集
  • 仪器设置：匹配荧光团与激光器（如FITC用488 nm，APC用633 nm），调整PMT电压。
  • 对照：设置未染色、单染和同型对照，用于补偿和特异性验证。
  • 上机：转移至流式管，采集50,000-100,000个事件，流速控制在200-500 events/s。
  • 门控：FSC/SSC圈定淋巴细胞，CD3⁻筛选NK细胞，再细分亚群。
• 5. 数据分析与特定亚群分析
  • 软件：用FlowJo或Cytobank导入FCS文件。
  • 门控策略：
    • 总淋巴细胞门：FSC/SSC散点图圈定淋巴细胞，排除碎片。
    • 活细胞门：用7-AAD⁻排除死细胞。
    • NK细胞门：人用CD3⁻CD56⁺筛选总NK细胞，小鼠用CD3⁻NK1.1⁺或CD49b⁺。
    • 特定亚群分析：
      • 人CD56^brightCD16⁻：在CD3⁻CD56⁺门中，筛选CD56^highCD16⁻细胞，评估其细胞因子分泌潜能（结合IFN-γ染色）。
      • 人CD56^dimCD16⁺：在CD3⁻CD56⁺门中，筛选CD56^lowCD16⁺细胞，检测杀伤受体（如NKG2D、KIR）表达水平。
      • 小鼠iNK (CD11b⁻CD27⁺)：在CD3⁻NK1.1⁺门中，筛选CD11b⁻CD27⁺细胞，代表未成熟亚群，具增殖能力。
      • 小鼠mNK (CD11b⁺CD27⁻)：在CD3⁻NK1.1⁺门中，筛选CD11b⁺CD27⁻细胞，反映成熟杀伤功能。
  • 荧光补偿：基于单染对照调整荧光溢出。
  • 结果解读：
    • CD56^bright比例升高：提示免疫调节增强，可能与炎症或淋巴组织激活相关。
    • CD56^dim比例主导：正常外周血特征，杀伤功能占优，异常降低可能与肿瘤微环境抑制有关。
    • 小鼠CD11b⁻CD27⁺增多：提示NK细胞处于发育早期或增殖状态。
    • NKG2D/KIR表达变化：高表达提示杀伤活性增强，低表达可能与免疫逃逸相关。
  • 输出：生成散点图（如CD56 vs. CD16、CD11b vs. CD27）、直方图，计算亚群比例和MFI。

注意事项

• 全程避光操作，避免荧光猝灭。
• 样本制备后2小时内上机，防止细胞凋亡。
• 用40-70 µm滤网去除团聚细胞。
• 定期校准仪器，确保数据一致性。

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参考文献

[1] Vivier E, et al. Functions of natural killer cells. Nat Immunol. 2008.
[2] Freud AG, Caligiuri MA. Human natural killer cell development. Immunol Rev. 2006.
[3] Morvan MG, Lanier LL. NK cells and cancer: innate immunity and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016.
[4] Wang X, et al. Tumor microenvironment–driven NK cell dysfunction. Life Sci. 2023. DOI:10.1016/j.lfs.2023.121997