abinScience助力解析非洲猪瘟病毒I10L如何瓦解宿主自噬防御

I10L是ASFV右侧可变区中抑制宿主自噬的关键蛋白

研究者对ASFV基因组右侧可变区编码的10个蛋白（L11L、I10L、I9R、I8L等）进行系统筛查，在HeLa细胞中过表达后检测自噬标志蛋白LC3-II和SQSTM1/p62的水平变化。结果显示，I10L能显著提升LC3-II和SQSTM1/p62的蛋白水平，且呈时间和剂量依赖性。GFP-LC3点状聚集实验进一步证实，I10L表达使细胞内自噬体数量明显增多。

Figure 1. ASFV I10L表达诱导自噬标志蛋白的积累

I10L阻断的是自噬通量中的融合步骤，而非自噬起始

为区分"自噬启动增强"与"自噬通量受阻"两种可能，研究者分别使用氯喹（CQ）、巴弗洛霉素A1（Baf-A1）抑制自噬体-溶酶体融合，以及EBSS饥饿或INK128处理激活自噬起始。在CQ或Baf-A1已阻断自噬通量的条件下，额外表达I10L不会进一步升高LC3-II和SQSTM1/p62，提示I10L与上述抑制剂作用于同一节点。在ATG5敲减条件下，I10L同样无法进一步累积上述标志物。使用RFP-GFP-LC3双荧光探针追踪自噬流，I10L表达细胞中代表未成熟自噬体的黄色点状物显著积累，直接证实I10L阻断自噬体与溶酶体的融合步骤。

Figure 2. I10L表达抑制自噬通量

I10L抑制自噬需要跨膜结构域与C端功能区的协同作用

I10L全长170个氨基酸，包含N端小片段、跨膜结构域TM和C端功能区。免疫荧光定位显示，全长I10L和仅含TM结构域的截短体（I10L-NTM）均可定位至LAMP1标记的溶酶体区室，缺失TM的截短体则无此定位。功能验证实验表明，单独缺失TM或C端均可完全丧失对自噬的抑制效果。TM结构域负责将I10L锚定至溶酶体，C端负责效应功能，两者缺一不可。

Figure 3. TM结构域和C端对I10L介导的自噬阻断至关重要

I10L特异性结合晚期内体/溶酶体标志分子RAB7

RAB7是晚期内体/溶酶体上的核心调控GTPase，在自噬体-溶酶体融合中发挥"锚定桥"作用。研究人员发现I10L与RAB7标记的晚期内体/溶酶体高度共定位，与RAB5（早期内体）和RAB11（循环内体）则无共定位。co-IP实验证实，I10L特异性与RAB7结合，不与RAB5、RAB11或其他SNARE蛋白结合。在ASFV感染的原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中，内源性I10L与RAB7同样存在相互作用并共定位。过表达RAB7可缓解I10L引起的自噬标志物积累，而RAB7敲减条件下I10L无法进一步加剧自噬阻断，证明I10L正是通过劫持RAB7发挥抑制效应。分裂荧光实验进一步将相互作用界面精确定位至I10L的C端aa 67–148区域。

Figure 4. I10L与RAB7相互作用

I10L竞争性占据RAB7，阻断其与HOPS复合体亚基VPS39的结合

HOPS复合体通过亚基VPS39与RAB7结合，驱动晚期内体/溶酶体的膜融合。co-IP结果显示，I10L表达显著削弱RAB7与VPS39之间的相互作用，且呈剂量依赖性。免疫荧光进一步证实，全长I10L使VPS39与内源RAB7的共定位明显减少，而单独的TM或C端截短体则无此效应。值得注意的是，I10L不影响HOPS亚基VPS41与STX17之间的结合，提示其靶向的是RAB7-VPS39这一特定结合界面，而非整个HOPS复合体。ASFV-ΔI10L感染实验进一步证实，缺失I10L后VPS39与RAB7的相互作用得到恢复。

Figure 5. I10L防止RAB7-VPS39聚集

I10L选择性瓦解STX17-SNAP29-VAMP8 SNARE复合体的组装

RAB7-HOPS轴的破坏最终导致下游SNARE复合体无法正确组装。co-IP实验显示，I10L表达显著降低STX17与SNAP29、STX17与VAMP8之间的结合，但不影响VAMP8与SNAP29之间的直接结合，免疫荧光共定位结果与此一致。在ASFV感染模型中，ASFV-WT感染细胞中STX17-SNAP29相互作用明显下降，而ASFV-ΔI10L感染则不产生此效应。I10L不干扰YKT6-SNAP29-STX7复合体，体现其对STX17通路的高度选择性。

Figure 6. I10L抑制STX17-SNAP29-VAMP8复合物的形成

I10L缺失显著削弱ASFV在原代巨噬细胞中的复制能力

将ASFV-ΔI10L与亲本病毒ASFV-WT接种于PAMs和pBMDMs，qPCR和免疫印迹均显示ASFV-ΔI10L的复制能力显著下降，病毒基因组拷贝数和p72蛋白表达均明显低于野生型。ASFV-ΔI10L感染细胞中LC3-II和SQSTM1/p62水平回落，说明自噬通量在I10L缺失后得到部分恢复。研究据此提出整体机制模型：ASFV感染后I10L早期表达，竞争性结合RAB7，阻断HOPS组装，进而瓦解SNARE复合体，使自噬体积累而无法降解，从而促进ASFV复制。

Figure 7. ASFV I10L的缺乏导致病毒介导的自噬恢复