第2期｜抗体的选择与验证全流程：从亲和力到特异性，怎么选都有理

在生命科学研究和疾病机制探索中，抗体是应用最为广泛的分子工具之一。然而，即使是同一靶标，不同抗体在实验中的表现差异也可能极大。如何科学地评估、筛选并验证抗体，直接决定了实验数据的可靠性与可重复性。本期，我们将围绕抗体的来源、纯化方式、验证方法等关键要素展开系统解析，助力科研人员优化实验设计，提升数据质量。

不同实验技术对抗体性能的要求不同，应根据具体应用场景进行精准选择。常见实验类型如下表所示：

Fig.1. 常见实验类型示意图

抗体的纯化方式直接影响其纯度、特异性和背景信号水平。常见方式包括：

• Purification: Antigen Affinity
• Purification: None 或 Serum (Unpurified)

实验是否涉及酶标（二抗检测）、荧光标记（用于FACS或IF）？应根据下游应用预判是否需要 HRP、FITC、PE 等标记类型。选用预标记抗体（pre-labeled antibodies）不仅可提升实验效率，还能避免非特异性结合和批间差异。

高质量抗体应附带详细的实验验证信息。包括但不限于：

• Western Blot 条带位置是否准确；
• IHC 染色是否具备组织定位清晰对比；
• 是否有使用 KO/siRNA/过表达等手段确认抗体特异性；
• 是否引用文献支持。

在标准科研体系中，单一验证手段往往难以全面评估抗体质量。建议基于正负对照样本 + 多策略验证机制，对抗体进行系统验证。以下为当前主流方法：

• RNA干扰验证（siRNA/shRNA knockdown）
  通过小干扰RNA降低靶蛋白表达水平，进而检测抗体信号是否同步下降。该方法适用于细胞模型，常结合Western blot进行分析。
•  基因敲除模型验证（Knockout, KO）
  采用KO细胞系或小鼠模型作为阴性对照组，若抗体信号完全消失，则特异性高度可信。此类策略已成为多家高端抗体供应商产品验证的“金标准”。
• 天然阴性样本验证
  例如某些膜蛋白在部分组织中不表达，可用于组织染色的阴性对照，如 CD20 在T细胞中为天然阴性表达。
•  过表达系统验证
  通过转染质粒在低表达背景中构建过表达模型，判断抗体能否识别外源蛋白信号并呈现正确分子量。尤其适用于条带位置的初步识别与排查。

Fig.2. 抗体验证方法示例结果(IF结果）

验证手段宜交叉互证：如 KO + siRNA 双重验证更具说服力；

控制组必须设置完整：包括内参、异种抗体对照、同型对照；

条带判断应结合数据库信息：如 Uniprot 或 Swiss-Prot 提供的蛋白分子量及剪接变体信息。

高质量的抗体不仅仅是“信号强”，更要“专一、稳定、可重复”。验证不充分的抗体往往是实验失败、结果不一致甚至误判机制的根源。

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