一、实验前材料准备
① 手术器械：包括眼科剪、眼科镊等。
② 培养皿：一次性塑料培养皿。
③ 滤网：70 μm或200目滤网用于过滤细胞团块，保证得到单细胞悬液。
④ 离心管：15 mL或50 mL的离心管，用于收集和离心细胞。
⑤ PBS 或培养基：用于清洗细胞。
备注：如果细胞后续用于培养请将材料消毒，保证无菌。
二、小鼠胸腺获取
颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出小鼠置于操作台上。用剪刀和镊子在胸骨位置剪开一个小口，由此小口撕裂皮肤暴露出胸骨。剪断心脏前方胸骨及两侧肋骨，由心脏上方的前纵隔内小心取出胸腺，浸泡在1×PBS缓冲液中。
图1.小鼠胸腺位置展示（绿色框）
三、脾脏单细胞悬液制备
① 用5 mL注射器活塞/柱塞的扁平末端部分或用研磨棒以温和画圆的方式研磨胸脏，碾磨至无明显红色结团。
② 70 μm或200目滤网过滤细胞，再用适量PBS/培养基冲洗滤网，收集细胞于离心管中。300-500 g离心5 min，弃上清。
③ 用PBS或培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度到1×107/mL。
图2. 小鼠胸腺FSC/SSC结果图
四、注意事项
① 打开胸腔时注意不要弄破心脏或大血管。
② 研磨力度尽量轻柔，避免造成过多机械性死亡的细胞。
③ 收集的胸腺细胞如需进一步培养，请注意无菌操作；如果只是做普通的流式实验，则可以不考虑无菌环境。
④ 细胞计数可以使用血细胞计数板或者自动细胞计数仪来计数细胞。
⑤ 为保持细胞活性，减缓代谢，尽量全程低温操作（在冰上或4℃环境）。
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